РЗГА широко применяется в практике как для выявления и определения титра антител в сыворотке крови больных и вакцинированных животных, так и для идентификации выделенных вирусов по известной сыворотке. Ставить эту серологическую реакцию можно только с теми вирусами, которые обладают гемагглютинирующими свойствами.
Сущность РЗГА заключается в том, что, если к вирусу, обладающему гемагглютинирующими свойствами, добавить сыворотку, содержащую специфические вирусу антитела, и смесь выдержать в контакте 30-60 минут, а затем внести взвесь эритроцитов, гемагглютинация не наступит, т.е. произойдет задержка (торможение) гемагглютинации. Следовательно, здесь гемагглютинирующая способность вируса нейтрализуется специфическими антителами.
При постановке реакции следует иметь в виду, что некоторые жидкости организма (сыворотка крови, моча, слюна, молоко и др.) могут содержать ингибиторы, которые могут тормозить реакцию и задерживать гемагглютинацию. В этих случаях нормальная сыворотка, т. е. сыворотка от здоровых животных, может дать задержку гемагглютинации, что приведет к ошибочным результатам. В сыворотках крови некоторых здоровых людей и животных выявлено два типа ингибиторов - термостабильные и термолабильные. Термолабильные ингибиторы обнаруживаются в бета-фракциях глобулина и они обладают свойствами бета-глобулина, подавляют гемагглютинацию, нейтрализуют вирус и являются важным фактором противовирусного иммунитета. Они мешают постановке РЗГА и от них избавляются инактивированием сыворотки при 56-65°С в водяной бане 30 минут. Термостабильные ингибиторы (ингибиторы Френсиса) содержатся в альфа-фракции глобулина, они устойчивы к высоким температурам (даже к кипячению) и действию щелочи, подавляют гемагглютинацию, но вируснейтрали- зующими свойствами не обладают. Удаляют термостабильные ингибиторы из сывороток крови обработкой сывороток углекислым газом, фильтратом культуры Вибриона холеры или перйодатом калия.
Для постановки РЗГА необходимо предварительно провести титрацию вируса в РГА, чтобы определить 1 АЕ. При постановке РЗГА вирус берут в титре 4 АЕ, т. е. разведение в 4 раза меньшее, чем был титр вируса в РГА. Например, титр вируса, содержащий 1 АЕ, равен 1:64, значит 4 АЕ будет содержаться в разведении вируса 1:16.
Все сыворотки перед постановкой РЗГА прогревают для удаления термолабильных ингибиторов в течение 30 минут при температуре 56-65°С в зависимости от вида животных.
Для постановки реакции в одном ряду пробирок или лунок готовят разведения сыворотки на физиологическом растворе. Обычно в первой пробирке готовят разведение 1:10, а далее из него двухкратные разведения до 1:1280 и иногда более высокие. Затем из этого ряда по 0,25 мл соответствующих разведений сыворотки переносят во второй ряд пробирок и туда же добавляют по 0,25 мл вируса, содержащего 4 АЕ. Встряхиванием пробирок жидкость перемешивают и смесь выдерживают 30-60 минут в контакте при комнатной температуре или в термостате. После этого во все пробирки вносят по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов, пробирки встряхивают и вновь выдерживают смесь в контакте 30-60 минут. Параллельно ставят контроли:
а) контроль сыворотки на спонтанную агглютинацию: к 0,25 мл сыворотки, в разведении 1:20 добавляют 0,25 мл физраствора и 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов (сыворотка не должна давать агглютинации);
б) контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию; к 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов добавляют 0,5 мл физраствора. Агглютинации не должно быть;
в) контроль реакции с нормальной сывороткой и антигеном - агглютинация должна быть. / СЦ
В положительных случаях при учете РЗГА будет отсутствовать агглютинация эритроцитов, в то время как этот же вирус без добавления сыворотки и с нормальной сывороткой будет вызывать четкую гемагглютинацию. С помощью РЗГА можно определить нарастание титра антител в процессе динамики болезни. Титром антител считается наивысшее разведение сыворотки, которое задерживает проявление гемагглютинации.
С пары: компоненты: сыворотка (известная диагностическая положительная отрицательная\неизвестная исследуемая), антиген (берут в количестве 4 ГАЕ), однопроцентные эритроциты.
Цель постановки: идентификация вируса, титр антител и динамика их нарастания
Учет реакции: в первой пробирке, где больше всего сыворотки – эритроциты оседают на дно в виде пуговки; далее начинается агглютинация; в конце – зонтик.
Диагностика: чума плотоядных, гепатит плотоядных, псевдочума