Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА основан на использовании для диагностики антител меченых ферментами. Для метки применяют такие ферменты как пероксидазу хрена (Пероксидаза хрена (англ. Horseradish peroxidase, HRP) — фермент, выделенный из хрена, широко применяющийся в молекулярно-биологических методиках для усиления слабого сигнала до уровня, необходимого для детекции), щелочную фосфатазу и др. Используют ИФА для выявления и идентификации как вируса, так и антител к нему.
Для идентификации вируса иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимический и твердофазный. *.
Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция, аналогична методу иммунофлуоресцен^ии (МФА), но отличается тем, что для постановки реакции используются антитела меченые не флуорохромом, а ферментом и учет реакции проводят просмотром под обычным световым микроскопом. В этом варианте ИФА используются антитела, меченые нероксидазой хрена. Выявляют вирусный антиген (вирусы) в мазках-отнечатках из органов, мазках крови, гистосрезах, культурах клеток зараженных вирусом. Ставят им- мунопероксидазную реакцию по прямому и непрямому варианту.
а) Для ^выявления вируса по прямому варианту используют меченые пероксидазой специфические вирусу антитела. Такие меченые антитела (конъюгаты) готовят в учреждениях биологической промышленности.
Мазки-отпечатки из патматериала, культуры клеток, выращенные на покровных стеклах и зараженные вирусом, фиксируют при -10°, -20°С ацетоном, высушивают на воздухе и затем на мазок наносят иммуно- пероксидазный конъюгат в рабочем титре, инкубируют при 37°С во влажной камере 1-2 часа, 15 минут промывают физраствором, затем споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Затем наносят несколько капель субстрата- это вещества, которые под действием ферментов разлагаются, образуя цветной продукт ферментативной реакции. Для пероксидазы хрена в качестве субстрата применяют диаминобензидинтетрахлорид, 5-аминосалициловую кислоту, ортотолуидин, ортодимилендиамин. Чаще используют диаминобензидинтетрахлорид. Мазок с нанесенным субстратом инкубируют 5-10 минут, промывают 10-15 минут физ раствором, споласкивают дистиллированной водой. Учет результатов проводят под обычным световым микроскопом. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в мазках, после нанесения иммунопероксидазного конъюганта образуется комплекс «Аг + Ат», меченый ферментом. После нанесения на препарат субстрата последний под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментации, хорошо видимый в световом микроскопе. Образуется при разложении продукт реакции голубого цвета, который быстро переходит в коричневый и будут видны или равномерное диффузное желто-коричневое окрашивание или гранулы коричнево-черного цвета. В контроле окрашивания не будет. Также обрабатывают и гистосрезы, но контакт конъюганта удлиняют до 6 часов.
б) При непрямом методе ИФА используют антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты (антивидовые антитела меченые пероксидазой). На фиксированный охлажденным ацетоном препарат (мазок- отпечаток, мазок, гистосрез) наносят первоначально специфическую искомому антигену сыворотку, контактируют 1-2 часа во влажной камере, промывают физраствором 5 минут, высушивают на воздухе, затем наносят антивидовой иммунопероксидазный конъюгат и инкубируют при 37°С 1-6 часов во алажной камере и далее как и при прямом методе. Учет проводят также под световым микроскопом.
Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) основаны на применении антител (или антигена) фиксированных на нерастворимых носителях. В качестве носителей используют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или керамические пробирки и микропанели с плоским дном, латекс.
Применение ТФР1ФА используется как для обнаружения вирусного антигена, так и для специфических антител. В этом методе используют меченые как пероксидазой хрена, так и щелочно-фосфатазные.
Для выявления вируса с помощью данного метода в вируссодержащем материале наиболее часто используют метод двойных антител или 4сэндвич». Для этого лунки полистироловых микропанелей сенсибилизируют гамма-глобулином, выделенным из специфической к исследуемому антигену сыворотки. В лунки вносят по 0,2 мл гамма-глобулина в нужной концентрации в натрий-карбонатном буфере с рН-9.6,
инкубируют 1 час при 37°С и затем оставляют на ночь при 4°С. Наутро риз лунок сливают раствор гамма-глобулина, промывают лунки панели 3 раза по 5 минут калий-фосфатным буфером с рН-7.4, затем в лун- ки вносят по 0,2 мл раствора, содержащий антиген, и инкубируют 2 часа при 37°С. В контрольные лунки вносят заведомо известный положительный и негативный антигены. Микропанели затем промывают 3 раза по 5 минут калий-фосфатным буфером. Затем в лунки вносят по 0.2 мл иммуноферментного конъюгата и инкубируют 1-2 часа при 37°С, промывают калий-фосфатным буфером 3 раза по 5 минут и вносят в лунки по 0.2 мл раствора субстрата (для иммуно- пероксидазного конъюгата применяют ортофенилендиамин или 5-ами- носалициловая кислота, а для щелочно-фосфатазного конъюгата р-нит- рофенилфосфат), инкубируют в темноте при комнатной температуре 5-30 минут. Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2Н H2S04 (для пероксидазы) и ЗМ NaOH (для щелочной фосфатазы). Учитывают реакцию визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов. При использовании субстрата ортофенилендиамина положительные образцы имеют оранжево-коричневую окраску, а при 5-ами- носалициловой кислоты опытные образцы окрашиваются в интенсивно-коричневый цвет, контрольные образцы или неокрашенные, или слабо-желтые. При использовании щелочной фосфатазы опытные образцы окрашены в желтый цвет. Учет реакции ИФА можно проводить с помощью спектрофотометра.