Сущность, техника постановки и учет реакции связывания комплемента (РСК).

Из серологических реакций, применяемых для диагностики вирус­ных болезней, РСК является наиболее трудоемкой и сложной. Ставят РСК для диагностики многих вирусных болезней, но особенно широ­ко для диагностики и типизации вируса ящура. РСК является высоко чувствительной серологической реакцией, позволяющей определять в исследуемом материале как антиген, так и антитела и устанавливать их количество.

Для постановки реакции необходимы пять компонентов, из которых только один является неизвестным (антиген или антитело 4шксистемы), а остальные четыре компонента должны быть заранее известными.

Антигеном в РСК служит вируссодержащий материал. Если про­водят исследования сывороток крови от больных или переболевших животных на наличие комплементсвязывающих антител, то антиген берут заранее известный (стандартный). Готовят такие антигены на биофабриках и выпускают с определенным титром.

Чаще антиген в РСК является неизвестным компонентом и его го­товят в лабораториях сами из присланного для исследований матери­ала. В этом случае для определения антигена применяют стандартные биофабричные иммунные сыворотки (при ящуре типоспецифические). Вируссодержащий материал для приготовления антигена берут с со­блюдением стерильности из тех органов и тканей, в которых происхо­дит наибольшее накопление вируса (при бешенстве и энцефаломие­лите - мозговая ткань, при ящуре - афты и их содержимое, при вирус­ным, гепатите - печень и т. д.).

Из вируссодержащего материала готовят суспензию измельчением и растиранием в ступке со стерильным битым стеклом или кварцевым песком и к растертой массе добавляют двойное количество по отноше­нию к массе взятого патматериала фосфатного буфера или физиологи­ческого раствора с рН 7,2-7,4. Суспензию переносят в центрифужные пробирки и подвергают 2-3 - кратному замораживанию при -20-50° С с последующими оттаиваниями в термостате или при комнатной тем­пературе, а затем центрифугируют при 3000 оборотов в минуту и по­лучают прозрачную надосадочную жидкость, которую и используют в качестве антигена. Такой антиген можно консервировать мертиолатом 1:10.000. Хранят антиген в холодильнике при +4°С.

В качестве антигена может служить также жидкость из заражен­ных вирусом куриных эмбрионов и культур тканей.

Сыворотки. Для диагностических целей используют стандартные нормальные и иммунные сыворотки, которые готовят на биофабри­ках путем гипериммунизации животных и выпускают расфасованны­ми в ампулах с определенным титром антител. Для диагностики ящу­ра на биофабриках готовят типоспецифические сыворотки путем гипериммунизации кроликов каждым типом вируса ящура в отдель­ности. Поэтому сыворотка для бактериолитической системы РСК чаще является заранее известным компонентом и по ней определяют изуча­емый антиген по специфичности их взаимодействия. Сыворотки крови от больных или переболевших животных для исследования на наличие антител присылают из хозяйств.

Все сыворотки для РСК стандартные и исследуемые предваритель­но инактивируют прогреванием в водяной бане при 56-65° С в зависи­мости от вида животных.

Комплемент. Комплемент - это неспецифический термолабильный белок, фактор литического действия (по французски - дополнение), содержащийся в нормальной сыворотке крови любого животного и че­ловека. Особенно много комплемента содержится в сыворотке крови морских свинок. Поэтому в качестве комплемента в РСК обычно ис­пользуют сыворотку крови морских свинок. Получать комплемент можно в лаборатории. Для этого берут кровь у морских свинок из сер­дца стерильным шприцем, ставят на 1-2 часа в термостат или теплое место для свертывания, затем обводят стеклянной палочкой и центри­фугируют для отделения сыворотки или отстаивают 18-20 часов в хо­лодильнике, сыворотку пипеткой отсасывают и сохраняют в холодиль­нике при +4°С. Биофабриками выпускают лиофильно высушенный (сухой) комплемент в ампулах, который, может сохраняться до года. Перед Использованием сухого комплемента его предварительно ра­створяют до нативного состояния, т. е. доводят до объема, указанного на ампуле добавлением физраствора, а затем из него готовят разведе­ния для титрования и на главный опыт РСК.

Комплемент не обладает специфичностью и в зависимости от ре­зультатов реакции может участвовать или в баксистеме (при положи­тельной реакции) или в гемсистеме (при отрицательной реакции). Он очень нестоек и быстро разрушается при хранении, воздействии света, при встряхивании и нагревании. Температура 56-58°С разрушает ком­племент за 30 минут. Сыворотка крови, лишенная комплемента, назы­вается инактивированной. Инактивацию сывороток проводят прогре­ванием их в водяной бане. Комплемент в РСК берут в строго определен­ных количествах, чтобы его хватило только на одну систему, а поэтому его предварительно титруют. При избытке комплемента он может уча­ствовать в бактериолитической и гемолитичёской системах, что приве­дет к ошибке в постановке диагноза.

Комплемент обладает свойством лизировать антиген, но только в присутствии и при помощи специфического антитела.

В реакцию комплемент может вступать только при наличии комп­лекса «антиген + антитело», а в отдельности с каждым из них компле­мент не соединяется. Поэтому, если в бактериолитической системе не будет такого комплекса «антиген + антитело», комплемент остается свободным несвязанным и переходит в гемолитическую систему, где и вызывает гемолиз, т. к. гемсистема является индикаторной системой и в ней всегда есть комплекс «антиген + антитело» в виде гемолизина (антитело) и эритроцитов барана (антиген для гемолизина).

Перед постановкой главного опыта РСК (в день постановки) комп­лемент обязательно титруют в гемолитической системе. Для этого бе­рут ряд пробирок и комплемент, разведенный 1:20, разливают в дозах: в первую пробирку 0,05 мл, во вторую - 0,10 мл, в третью - 0,15 и так далее с интервалом 0,05 мл до 0,40 мл. В каждую пробирку затем недо­стающее количество до объема 0,5 мл доливают физраствором. Это будет соответствовать 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 и 4% цельного комп­лемента, содержащего в дозе 0,5 мл разведения с физраствором. Затем в пробирки вносят по^5_мл.гемолизина в рабочем титре и 2%-ной взвеси эритроцитов (лучше заранее приготовить гемолитическую систе­му, т. е. смешать гемолизин в рабочем титре с равным объемом 2%-ной взвеси эритроцитов, и вносить гемолитическую систему по 1,0 мл) и по 1 мл физраствора (см. схему).

Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню при 37-38°С на 15 минут, после чего проводят учет реакции. Титром комплемента счи­тается то наименьшее его количество, которое вызывает полный гемо­лиз эритроцитов. При определении типов вируса ящура используют комплемент, который при указанных условиях имеет титр не ниже 2,5%.

В дальнейшем для постановки главного опыта (например, при ящу­ре) комплемент берут с постоянным излишком в 1%, или две условные единицы от титра его в гемолитической системе. Например, если титр комплемента в гемсистеме будет 1,5%, то за рабочее разведение его сле­дует взять 2,5%, что составляет 2 единицы.

Гемолизин. Это специфическое антитело на эритроциты барана. Получают гемолизины на биофабриках путем гипериммунизации кро­ликов эритроцитами барана и в результате у кроликов на эти эритро­циты (как антиген), образуются антитела - гемолизины. Кролика затем обескровливают и получают сыворотку. Сыворотка крови кро­лика, содержащая гемолизины, называется «гемолитическая сыворотка». Такую сыворотку инактивируют прогреванием в бане для разрушения комплемента, консервируют (иногда глицерином 1:1) и расфасовыва­ют по ампулам. Выпускают гемолизин биофабрики в жидком или су­хом виде (при консервировании глицерином 1:1 следует учитывать при приготовлении разведений гемолизина).

Гемолизин обладает свойством лизировать эритроциты барана, но только в присутствии комплемента и при его помощи.

Гемолизин в лаборатории обязательно титруют при получении све­жей серии и затем один раз в два-три месяца. Для титрования его раз­водят физраствором. Первое разведение готовят 1:100, для этого из ам­пулы (если консервирован глицерином 1:1, с учетом глицерина берут 0,2 мл и добавляют 9,8 мл физраствор) берут 0,1 мл и добавляют 9,9 мл физраствора. Из разведения 1:100 далее готовят основное разведение 1:1000 (берут 1 мл разведения 1:100 и добавляют 9 мл физраствора), из которого затем готовят дальнейшие разведения: 1:1500; 1; 2000; 1:3000; 1:4000; 1:5000; 1:6000 (см. схему).

Затем в пробирки второго ряда берут по 0,5 мл соответствующих разведений гемолизина, добавляют по 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроци­тов, по 0,5 мл комплемента в разведении 1:20 и по 1,0 мл физиологи­ческого раствора (вместо антигена и сыворотки). Пробирки выдержи­вают в бане при 37-38°С 10 минут после чего проводят учет реакции.

Титром гемолизина считают то наивысшее разведение его, которое вызывают полный гемолиз эритроцитов. Этот титр называется пре­дельным или номинальным. В главный опыт РСК гемолизин берут в рабочем титре. За рабочий титр гемолина считают четырехкратную концентрацию от его предельного (номинального) титра. Если предель­ный титр гемолизина равен 1:3000, то рабочий титр будет 1:750. Для дальнейшей работы гемолизин в рабочем титре (разведении) смеши­вают с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов и получают гемолитическую систему.

Эритроциты барана. Они являются антигеном в гемолитической системе (для гемолизина). Получают эритроциты в лаборатории от ба­рана или овцы. Для этого берут у барана кровь из яремной вены во флакон со стеклянными или фарфоровыми бусами и тщательно дефиб- ринируют встряхиванием, затем для освобождения от сгустков фибри­на фильтруют через марлю в центрифужные пробирки и центрифуги­руют 10-15 минут при 2-3 тысячах оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку эритроцитов добавляют физраствор, пе­ремешивают и вновь центрифугируют. Надосадочную жидкость опять удаляют, вносят новую порцию физраствора и так отмывают эритроци­ты физраствором до тех пор пока надосадочная жидкость будет оста­ваться бесцветной (3-5 раз). После отмывания надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, а из осадка эритроцитов готовят 2%-ную взвесь, которую и используют для постановки РСК и для титраций.

Для длительного хранения эритроцитов в последнее время широко используется раствор Альсевера (на 100 мл дистиллированной воды берут декстрозы 20,5 г, цитрата натрия 8,0 г, лимонной кислоты 0,55 г, хлористого натрия 4,2 г), который стерилизуют 10 мин при 0,6 атм. в авуоклаве и добавляют на 2 части крови 1 часть раствора Альсевера. I у>ДЛ Вышеуказанные пять компонентов составляют в РСК две системы: (^б^т^и^лщт^щю (антиген + иммунная сыворотка, т. е. антитело и комплемент) и гемолитическую (гемолизин и эритроциты барана).

Комплемент в положительных случаях участвует в бактериолити­ческой системе (баксистеме), в отрицательных - в гемолитической (гемсистеме). Гемолитическая система выполняет роль индикатора и по ней судят о том, как прошла реакция в баксистеме, баксистема - это диагностическая система.

Сущность РСК. Если в исследуемом патологическом материале имеется вирус (антиген), он соединяется с антителами иммунной сы­воротки и образуется комплекс «антиген + антитело», который связы­вает комплемент в баксистеме и свободного комплемента для гемсис- темы не остается. Поэтому при последующем добавлении в пробирки гемсистемы, несмотря на то, что там всегда есть комплекс «антиген (эритроциты барана) + антитело (гемолизин)», гемолиз эритроцитов не происходит потому, что для гемсистемы не осталось комплемента. Такая реакция считается положительной. Если исследуют сыворотки крови от больных или переболевших животных на наличие антител, то берут заранее известный стандартный антиген. Если в баксистеме не образовалось комплекса (не было в патматериале вируса, или не было в сыворотке крови антител), комплемент переходит в гемсистему и, соединяясь в ней с комплексом «гемолизин + эритроциты барана», вызывает гемолиз эритроцитов. Такая реакция считается отрицательной. Для постановки РСК необходимо выполнять следующие условия:

1) Ставить реакцию в строгой последовательности: вначале в бак­системе при 37-38 °С в течение 20 минут, или при температуре 3-4°С (в холодильнике) в течение 16-18 часов (РДСК), а затем в гемсистеме при 37-38°С в течение 30 минут;

2) Сыворотки инактивированные;

3) Каждый компонент вносят в количестве по 0,2 мл (или в минива- рианте по 0,025 мл) и в рабочих титрах, а поэтому перед постановкой РСК их титруют;

4) Общий объем жидкости в пробирке должен быть равен 1,0 мл (для микроварианта 0,125 мл). Если какой-либо компонент в реакцию не вносят (например, в контролях, при титрации), то вместо него вно­сят такое же количество физраствора;

5) Физиологический раствор применяют чистый, сдежий, проки^ пяченный и без консервантов; s ' t ^ ' С & \

Главный опыт РСК. При постановке главного оп^та вначале вно­сят компоненты факсисгешя и ставят реакцию в бдксистедое в водяной бане при 37-38°С 20 минут (РСК) или при +4°С в холодильнике в те­чение 16-18 часов (РДСК), а затем добавляют компоненты гемсисте­мы и ставят реакцию в гемсистеме при температуре 37-38°С 30 минут, после чего учитывают (читают) реакцию.

Наиболее часто РСК ставят для идентификации и типизации вы­деленных типов вируса ящура. При определении типов вируса ящура перед проведением главного опыта позитивные диагностические сыво­ротки и антиген не титруют, а используют их в удвоенном (т. е. двух­кратном) титре. Например, если титр сыворотки, указанный на этикет­ке, 1:40, то берут 1:20. Также поступают и со стандартными антигенами.

Все компоненты реакции разливают по 0,2 мл (в микроварианте по 0,025 мл). Испытуемый антиген в реакции исследуют цельный, т. е. приготовленная из афт суспензия на физиологическом растворе 1:2 (33%-ная взвесь), а также в разведениях 1:2, 1:4, 1:8. Реакцию ставят с различными типоспецифическими диагностическими ящурными сы­воротками параллельно, комплемент берут 2 единицы.

Цельный антиген и каждое его разведение вносят в пробирки по 0,2 мл, туда же затем добавляют по 0,2 мл стандартной диагностической сы­воротки в удвоенном титре и по 0,2 мл комплемента, содержащего 2 рабочие дозы (единицы). После встряхивания пробирки ставят на 20 минут в водяную баню при температуре 37-38°С. Затем в пробир­ки вносят по 0,4 мл гемолитической системы и снова ставят в водяную баню на 30 минут, после чего читают реакцию.

В данном примере антиген относится к типу О.

Одновременно ставят контроли: со стандартной позитивной сыво­роткой без антигена, с испытуемым антигеном без добавления сыво­ротки, с диагностической стандартной позитивной сывороткой и стан­дартным антигеном.

Учет реакции проводят сразу же после прохождения реакции в ге­молитической системе (это предварительный учет) и через несколько часов, т. е. после оседания эритроцитов (это окончательный учет). При повторном учете оценку реакции дают в крестах (++++, +++, ++, +, —), при этом во внимание берут наличие осадка эритроцитов на дне и цвет надосадочной жидкости. Полная задержка гемолиза (жидкость про­зрачная, бесцветная, на дне осадок эритроцитов) расценивается как положительная и обозначается ++++, если жидкость желто-розовая с осадком эритроцитов +++ и т. д. Если жидкость красная прозрачная и нет эритроцитов в осадке, оценивают «—».

В последнее время для постановки РСК успешно применяют тех­нику постановки по микрометоду. Ставят реакцию при этом методе в объеме 0,125 мл и каждый компонент берут в объеме 0,025 мл.