1. В пробирку емкостью 0,5 мл вносят компоненты реакционной смеси в следующем порядке: деионизованная вода - 36 мкл 10х буфер для ПЦР - 5 мкл дНТФ - 1,5 мкл Праймер 1 - 1,0 мкл Праймер 4 - 1,0 мкл Taq ДНК-полимераза - 0,5 мкл РНК (исследуемый образец) - 5 мкл.
2. Встряхивают пробирку, все капли со стенок собирают центрифугированием в течение 5-10 с. На поверхность водной фазы наносят 50 мкл (2 капли) вазелинового масла.
3. Проводят амплификацию.
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах:
1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК). Протекает при 93-95 оС в течение 30-40 сек.
2 этап: Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК). Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65оС. Время отжига -20-60 сек.
3 этап: Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза - 20-40 сек.
Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемыхе праймерами. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.
Контроли реакции:
- К+ (положительный) - контрольная кДНК, входящая в состав тест-системы,
- К - (отрицательный) - деионизованная вода.
Смеси для контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемого образца.
ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);
Праймеры (синтетические олигонкулеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплиментарны последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа;
Смесь (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);
Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК);
Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.
Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двуцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.
Результаты исследования учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.
1. Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л буфера для электрофореза к 100 мл 10-кратного раствора ТBE добавляют 900 мл воды.
2. Приготовление 2 % агарозного геля (в соответствии с инструкцией в наборе).
В 30 мл буфера для электрофореза добавляют 0,6 г агарозы. Нагревают взвесь до растворения агарозы. Охлаждают раствор до 50°С и добавляют бромистый этидий (из водного раствора, содержащего 10 мг/мл и хранящегося при 4°С в светонепроницаемом сосуде) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Охлажденную агарозу заливают в специальную форму и вставляют ‘гребенку”, от зубцов которой в геле останутся лунки для проб. Необходимо, чтобы между дном лунки и основанием геля оставался слой агарозы толщиной 0,5-1,0 мм. После того как гель полностью затвердеет (30-40 мин при комнатной температуре), осторожно удаляют ‘гребенку”. Помещают гель в аппарат для горизонтального электрофреза ("Диа-М''). Добавляют достаточное количество буфера для электрофореза, так чтобы гель был закрыт слоем буфера толщиной 1 мм.
3. Электрофорез продуктов амплификации.
Из пробирок с исследуемыми образцами после завершения амплификации отбирают по 3 мкл реакционной смеси, добавляют 2 мкл красителя (0,25% раствор бромфенолового синего. 0,25% ксиленцианола в формамиде), перемешивают наконечником для пипеточных дозаторов и вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки.
Электрофорез проводят при напряженнии 15 В/см длины геля в течении 30 минут.
4. Учет результатов.
Обычно бромистый этидий (0,5 мкг/мл) добавляют в гель. В его присутствии электрофоретическая подвижность линейной двухцепочечной ДНК снижается примерно на 15%, но при этом появляется возможность наблюдать за процессом разделения непосредственно под источником УФ - излучения во время или в конце разделения. Можно также проводить электрофорез в отсутствии бромистого этидия и окрашивать ДНК уже после завершения разделения. В этом случае гель помещают в электрофорезный буфер или воду, содержащие бромистый этидий, на 45 мин при комнатной температуре.
Предостережение. Бромистый этидий - сильный мутаген. Все манипуляции с гелями и растворами, содержащими краситель, необходимо проводить в перчатках.
Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе "Трансиллюминатор". Результаты реакции выявляют в виде светящихся красноватых полос. Положительными считаются пробы, в которых полосы в геле располагаются точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос.
Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос, или они не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе.
Преимущества: