Ни клинические признаки, ни РИД не позволяют провести дифференциальную диагностику чумы КРС и отличить ее от чумы мелких жвачных, поэтому в странах, где распространены обе болезни, при возникновении подозрений на заражение овец или коз любым из этих заболеваний, следует использовать другие тесты, например, ПЦР в реальном времени. Срочная дифференциальная диагностика возможна с помощью дифференциального ИФА с иммунозахватом (Libeau et al., 1994). В данном тесте используются моноклональные антитела против N белка обоих вирусов. Одно моноклональное антитело, реагирующее против обоих вирусов, используют в качестве иммобилизованного антитела, а второе биотинилированное моноклональное антитело, специфичное для неперекрывающегося сайта белка N антигена и специфичное либо против вируса чумы КРС, либо против вируса чумы мелких жвачных, предназначено для определения того, какой белок N был захвачен.
На ИФА-планшеты (или стрипы), обеспечивающие высокий уровень связывания белка, наносят иммобилизованные антитела в объеме 100 мкл на каждую лунку. После трех промывок в лунки добавляют по 50 мкл исследуемого образца,
разведенного 1/10 в лизирующем буфере, по 25 мкл вирус-специфического моноклонального антитела в рекомендованном производителем разведении и по 25 мкл стрептавидин пероксидазы в конечном разведении 1/3000. Затем планшеты помещают на шейкер с орбитальным вращением на 1 час при 37ºC, после чего снова промывают; после добавления 100 мкл орто-фенилендиамина, планшеты повторно инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1 N серной кислоты, результаты, считанные при 492 нм с помощью автоматического ИФА-ридера, выражают в единицах оптической плотности.
Хроматографический анализ в тест-полосках
Хроматографический экспресс-анализ в тест-полосках (Bruning-Richardson et al., 2011a) разработан для помощи работающим в поле специалистам во время подозрения на вспышку чумы КРС. Выявление положительных результатов считается указанием на возможный случай чумы КРС и влечет за собой срочные меры по проведению дополнительных исследований. Саму тест-полоску отправляют в соответствующую Референтную лабораторию МЭБ вместе с другим патологическим материалом, так как из использованной тест-полоски можно извлечь нуклеиновую кислоту вируса для его характеристики (Bruning-Richardson et al., 2011b).
Серологические тесты
Конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ
Существует конкурентный ИФА для обнаружения антител к вирусу чумы КРС в сыворотке животных любых видов, ранее зараженных вирусом. В основе теста лежит способность положительной исследуемой сыворотки конкурировать с моноклональным антителом к белку Н вируса чумы КРС за связывание с антигеном вируса чумы КРС. Присутствие таких антител в исследуемом образце будет блокировать связывание моноклонального антитела, продуцируя снижение ожидаемой реакции окрашивания после добавления меченного ферментом антимышиного IgG конъюгата и раствора субстрата/хромогена. Поскольку данный анализ является твердофазным, для удаления несвязанных реагентов, необходимы этапы промывки.
Антиген вируса чумы КРС получают из культур клеток почек теленка Madin-Darby, инфицированных аттенуированным штаммом Kabete «О» вируса чумы КРС и инактивированных нагреванием до 56ºC в течение 2 часов. Антиген вируса экстрагируют из инфицированных клеток посредством многократных циклов обработки ультразвуком и центрифугирования. Моноклональные антитела получают посредством слияния спленоцитов гипериммунизированных мышей с линией клеток миеломы NSO с последующей демонстрацией их специфичности для белка H вируса чумы КРС (Anderson et al., 1991); в настоящее время эти моноклональные антитела обозначают как С1. И антитела С1, и стандартизированный антиген вируса чумы КРС можно получить из Справочной лаборатории МЭБ по чуме КРС в Великобритании (см. Таблицу, представленную в Части 4 данного Руководства для наземных животных). Наборы есть в продаже.
Процедура теста
i i) Лиофилизированный антиген вируса чумы КРС восстанавливают с помощью 1 мл стерильной воды и разводят до рекомендованного производителем рабочего разведения, используя 0,01 М фосфатно-буферный раствор, рН 7,4.
i ii) Сразу после этого разведенный антиген в объемах по 50 мкл распределяют по соответствующему количеству лунок на плоскодонном микропланшете для ИФА, обеспечивающем высокий уровень связывания белка, выделяя по две лунки для каждой исследуемой сыворотки. Чтобы равномерно распределить антиген по дну каждой лунки, нужно слегка постучать по бокам микропланшета, затем запечатать его и инкубировать на шейкере с орбитальным вращением в течение 1 часа при 37ºC. Лунки промывают три раза 0,002 М фосфатно-буферным раствором, pH 7,4.
i iii) В каждую тест-лунку вносят 40 мкл блокирующего буфера (0,01 М ФБР, 0,1% (в объемном отношении) Тween 20 и 0,3% (в объемном отношении) нормальной бычьей сыворотки), а затем вносят все исследуемые сыворотки в объемах по 10 мкл.
i iv) Рабочее разведение моноклонального антитела в блокирующем буфере готовят в соответствии с рекомендациями производителя и вносят по 50 мкл разведенного моноклонального антитела в каждую тест-лунку. Планшеты запечатывают и снова инкубируют на шейкере с орбитальным вращением в течение 1 часа при 37ºC.
i v) Рабочее разведение кроличьего антимышиного иммуноглобулина, конъюгированного с пероксидазой хрена, в блокирующем буфере готовят в соответствии с рекомендациями производителя и вносят по 50 мкл иммуноглобулина в каждую тест-лунку. Планшеты запечатывают и снова инкубируют на шейкере с орбитальным вращением в течение 1 часа при 37ºC.
i vi) В конце этого этапа планшеты промывают, как указано выше, и сразу снова наполняют смесью субстрата и хромогена в объемах по 50 мкл (1 часть 3% Н2О2 к 250 частям орто-фенилендиамина) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут без встряхивания. Затем вносят 50 мкл стоп-раствора, состоящего из 1 М серной кислоты.
i vii) Данная тест-система должна включать положительные и отрицательные сыворотки, контроль для моноклонального антитела и контроль для конъюгата.
i viii) Полученные показатели оптической плотности измеряют на ИФА-ридере с интерференционным фильтром 492 нм и переводят в значения процента ингибирования в сравнении со значением, полученным при использовании контроля для моноклонального антитела. Значения процента ингибирования 50% и более указывают на положительный результат теста, значения ниже 50% - на отрицательный.
Снижение порога разграничения положительного/отрицательного результата до 40% и ниже повышает чувствительность теста, но негативно отражается на специфичности ввиду увеличения доли ложноположительных результатов теста. На практике, значение 50% рекомендовано GREP, при этом чувствительность теста составляет на менее 70%, а специфичность – более 99%. Чувствительность
следует учитывать при разработке планов отбора проб для серологического надзора.
Нейтрализация вируса
Золотой стандарт исследования – реакцию нейтрализации вируса – проводят на культурах первичных клеток почки теленка в роллерных пробирках методом Plowright & Ferris (1961); тест валидирован на экспериментально инфицированном КРС. В ходе процедуры, осуществляемой в роллерных пробирках, неинактивированные сыворотки разводят в интервалах от 1 до 10, затем, начиная с неразведенной сыворотки, смешивают с равным объемом аттенуированного вакцинного вируса штамм Kabete «O» в дозе 103,0 ТЦД50/мл. Смеси инкубируют в течение ночи при 4ºC, затем в каждую из пяти роллерных пробирок вносят по 0,2 мл, с последующим немедленным введением 1 мл диспергированных индикаторных клеток, суспендированных в ростовой среде в соотношении 2×105 клеток/мл. Пробирки инкубируют при 37ºC в течение первых трех дней в наклонном положении, затем повторно наполняют поддерживающей средой и помещают в роллер. Пробирки регулярно исследуют на наличие вирус-специфического цитопатогенного действия, положительные пробирки учитывают и убирают; окончательный учет результатов проводят на 10 день.
Для подсчета конечных показателей доза вируса считается достаточной, если конечное разведение находится в диапазоне от 101,8 до 102,8 ТЦД50/пробирку. Данный тест следует использовать для исследования сывороток от животных с положительной реакцией в ИФА в ходе национальных программ по серологическому надзору, проводимых с целью демонстрации свободы от инфекции или с целью отбора восприимчивого КРС для испытаний вакцины. В данных обстоятельствах считается, что присутствие любого количества обнаруживаемых антител в ½ конечного разведения сыворотки указывает на перенесенную инфекцию вирусом чумы КРС. Реакция нейтрализация вируса – является методом выбора при исследовании образцов сыворотки от диких животных.
В качестве скрининг-теста применяют метод с использованием микропланшетов. Для этого теста первоначальное разведение сыворотки (1/5) дополнительно разводят с двукратными интервалами. Затем сыворотку в объемах по 50 мкл инкубируют с вирусом в объемах по 50 мкл, разведенным таким образом, чтобы ТЦД50 разведения составлял от 101,8 до 102.8 (Taylor & Rowe, 1984). После инкубирования в течение 45 минут или в течение ночи вносят от 1 до 2 × 105 клеток почки теленка, клеток почки ягненка или Vero клеток в качестве индикаторов. Реакцию останавливают через 6-7 дней. При высоких концентрациях сыворотки в таких тестах может возникать неспецифическая нейтрализация. По-видимому, в некоторых сыворотках от здоровых животных (без перенесенной инфекции чумы КРС) могут присутствовать факторы, которые обуславливают неспособность вируса проникать и реплицироваться в индикаторных клетках. В ходе реакции в пробирках влияние данных факторов, вероятно, нивелируется во время смены поддерживающей среды; при проведении теста на микропланшетах данные факторы присутствуют в течение всего периода исследования. Если наивысшая концентрация конечного разведения сыворотки не превышает 1/10, то данный эффект исчезает.