i i) RBOK
Титрацию вируса проводят на посевном материале путем десятикратных разведений вируса на микропланшетах или в роллерных пробирках с использованием десяти репликатов на одно разведение.
Перед лиофилизацией готовый нефасованный продукт можно хранить при 4ºC не более 5 дней, а в случае замораживания при температуре от –20ºC до –60ºC – в течение значительно более длительного периода времени.
Исследования на наличие контаминации случайно занесенными вирусами проводят на двух неинфицированных контрольных клеточных культурах, приготовленных из клеточных суспензий, используемых для производства серии, после выдерживания их в той же среде и инкубирования в тех же условиях, что и культуры, зараженные вирусом чумы КРС. В процессе производства контрольные культуры регулярно изучают под микроскопом, и результаты таких исследований должны быть отрицательными. После сбора вируса контрольные культуры промывают с целью удаления бычьей сыворотки и повторно инкубируют в течение 10 дней в среде, содержащей заменители бычьей сыворотки, с регулярным исследованием под микроскопом на предмет наличия цитопатогенных изменений. По завершении этого периода одну из культур исследуют на присутствие нецитопатогенного вируса вирусной диареи КРС методом иммунофлуоресценции, иммунопероксидазным методом или методом ОТ-ПЦР.
Иммуногенность готового нефасованного продукта определяют путем титрации, как и в случае с посевным вирусом.
i ii) LA-AKO
Титрацию вируса проводят на каждой серии готовой промышленной суспензии путем десятикратных разведений вируса на микропланшетах или в роллерных пробирках с использованием четырех репликатов на одно разведение.
С целью обеспечения титра и свойств готовой промышленной суспензии проводят маркерный тест. LA-AKO индуцирует выраженную спленомегалию у зараженных куриных эмбрионов. 15 мкл десятикратного и стократного разведения образца готовой промышленной суспензии вводят в кровяной сосуд куриного яйца (для теста используют более 10 штук яиц) на 11 или 12 день кладки. Яйца инкубируют при температуре 38ºC в течение 5 дней. Селезенки куриных эмбрионов, оставшихся живыми после заражения, собирают и взвешивают. Селезенки должны стать тяжелее на 15 мг.
Исследования на наличие контаминации случайно занесенными вирусами проводят на не менее чем 1% неинфицированных контрольных клеточных культур, приготовленных из клеточных суспензий, используемых для производства промышленной суспензии, после выдерживания их в той же среде и инкубирования в тех же
условиях, что и культуры, зараженные вирусом чумы КРС. В процессе производства контрольные культуры регулярно изучают под микроскопом, и результаты таких исследований должны быть отрицательными. В день сбора вирусного материала контрольные культуры изучают под микроскопом на предмет наличия гемадсорбции. Культуры, не инфицированные вирусом чумы КРС, промывают для удаления фетальной телячьей сыворотки и делят на две группы. Каждую группу покрывают 0,1% суспензией эритроцитов морских свинок или гусей на 1 час, затем просматривают под микроскопом. В контрольных культурах не должно наблюдаться абсорбции эритроцитов этих видов.
Каждую серию готовой промышленной суспензии также изучают на наличие вирусной контаминации в in vitro и in vivo тестах. Для анализов in vitro образцы готовой промышленной суспензии смешивают с кроличьей антисывороткой с титром антител, нейтрализующим вирус чумы КРС, вносят в перевиваемые культуры почек и семенников теленка и инкубируют при 37ºC в течение 7 дней. Во время инкубирования в культуре клеток не должен возникать цитопатогенный эффект. Те же образцы также вносят в культуру клеток почки эмбрионов африканской мартышки, MA-104, которая считается высоко восприимчивой к ротавирусу обезьян (Smith et al., 1979). В зараженных культурах MA-104 цитопатогенный эффект должен отсутствовать. Для анализа in vivo образец готовой промышленной суспензии в объеме 10 мл смешивают с кроличьей антисывороткой с титром антител, нейтрализующим вирус чумы КРС, и вводят внутримышечно овце, восприимчивой к вирусу лейкоза КРС. Сыворотки, полученные от овцы через 2 и 3 месяца после заражения, исследуют на присутствие антител к вирусу лейкоза КРС в реакции иммунодиффузии в агаровом геле.
Готовую промышленную суспензию смешивают с криопротектантом и расфасовывают по флаконам в день лиофилизации. До добавления криопротектанта хранение готовой промышленной суспензии в течение более длительного периода времени возможно в случае ее замораживания при температуре -20ºC или ниже.