Потенциал - зависимый патриевый канал

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ

БОЛЬШОГО ПРАКТИКУМА

ПО ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

И ЖИВОТНЫХ

Раздел — Электрофизиология

Часть 1. Физиология возбудимых структур

Нижний Новгород 2007

УДК 591.1

Лабораторные работы большого практикума по физиологии челове­ка и животных. Раздел — Электрофизиология. Часть 1. Физиология воз­будимых структур. Периферические нервы/Составители: В. Н. Крылов, Л. В. Ошевенский. Н. Новгород: ИНГУ, 1998. 45с.

Составители:

профессор, док. биол. наук В. Н. Крылов.

доцент, канд. биол. наук Л. В. Ошевенский.

Рецензент:

доцент, канд. биол. наук В. Г. Ретивин.

Методическое руководство предназначено для студентов старших курсов, проходящих практические занятия в рамках общего курса "Фи­зиология человека и животных". Практические работы, включенные в данную методическую разработку, затрагивают раздел электрофизиоло­гии, в частности, физиологию возбудимых структур (периферические нервы).

© Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского, 1998

Биологическая мембрана

Композитная структура образующая наружную оболочку всех животных клеток, а также участвующая в формировании внутриклеточных органелл – называется биологической мембраной.

Биологические мембраны формируют замкнутые структуры и обеспечивают разделение внешней и внутренней среды. При этом мембраны выполняют барьерную функцию, препятствуя свободной диффузии веществ, регулируя процесс переноса веществ и соответственно их концентрацию.

Мембраны формируют внутриклеточную среду, и обеспечивают высокую сбалансированность протекания метаболических процессов.

Помимо граничной функции мембраны, обеспечивают: 1) внешнюю рецепцию физических и химических эффекторов поверхностными молекулами и преобразованием информации регуляторными мембранными белками; 2) обладают высокой ферментативной активностью за счет встроенных молекул ферментов; 3) обеспечивают транспорт электронов и фосфорилирование в цепи дыхания; 4) ферментативные процессы синтеза секретируемых продуктов; 5) преобразования внешних стимулов в электрические сигналы; 6) проведение биоэлектрических импульсов; 7) высвобождение синоптических нейромедиаторов.

Состав мембран

На (рис 1) представлена трехмерная схема модели биологической мембраны, которая наиболее наглядно демонстрирует ее морфо – функциональные свойства.

 

Рис1 Трехмерная схема жидко – мозаичной модели мембраны Сингра – Николсона.

Матрикс мембраны представлен липидами, это фосфоглицериды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин) и сфинголипиды (сффингомиелин). Эти соединения амфифильны т. е. имеют полярные головки и неполярные хвосты.

Группировки образующие полярные головку, гидрофобны (имеют сродство к воде), а неполярные хвостовые группы гидрофобны (не растворимы в воде).

Двойственная природа мембранных липидов образует бислой и позволяет организовать пограничные разделы в водных растворох, что служыт основой организации клеток и клеточных структур. Внутренний гидрофобный участок бислоя обеспечивает интеграцию в мембрану неполярных веществ и участков других образующих мембрану группировок.

Так для повышения вязкости мембран в состав гидрофобного участка бислоя встроены молекулы стерола что повышает жесткость мембраны и снижает ее текучесть, что является основой разнообразия и постоянства формы клеток и их органелл.

Мембраные белки, это элементы формирующие функциональные свойства мембран. Ферментативную активность определяют флавопротеины и цитохромы белки веутренней мембраны митохондрий, АТФазы, участвующие в активном транспорте, аденилаткиназа, которая катализирует превращение АТФ в цАМФ.

Белки не обладающие ферментативной активностью образуют ионные каналы, являются рецепторами связывающие гормоны, нейромедиаторы и другие эффекторы.

Белки мембран часто создают комплексные связи с липидами образуя липопротеины, что расширяет их функциональные свойства.

Одним из наиболее важным свойством биологической мембраны является ее проницаемость, точнее сказать полупроницаемость или перенос веществ через мембрану.

Пассивный, не энергозависимый перенос веществ через мембрану осуществляется в основном тремя путями, определяется физико-химическими свойствами растворенных веществ и растворителя.

Вещества, находящиеся в водной фазе по одну сторону мембраны, растворяются в липидном слое мембраны, диффундируют и переходят в водную фазу с противоположной стороны мембраны.

Растворенные вещества диффундируют через заполненные водой поры.

Молекулы вещества связываются с молекулами-переносчиками встроенными в липидный слой мембраны, и диффундируют в водную фазу с противоположной стороны мембраны из молекулы-переносчика.

Ионные мембранные каналы.

Мембранные каналы образованы белками, погруженными в мембрану, где образуют заполненные водой поры. Через канал диффундируют малые молекулы. Они движутся по градиенту концентрации. Движение молекул по каналу определяется как их размерами так и зарядом. Мембранные каналы обладают относительной избирательностью по отношению к типу молекул, которые через них проходят. Существуют, например, калиевые и кальциевые каналы, каждый из которых непроницаем практически для любого иона, кроме специфического. Такая селективность обусловлена зарядом или структурой стенки канала.

Калиевый канал

Калевый ионный канал имеет свой индивидуальный энергетический профиль, при чем этот профиль динамически изменяется при транспорте иона, что регулирует производительность канала при взаимодействии со средой. На (рис2) представлена схема калиевого канала, где четыре отрицательных заряда зафиксированы на стенке канала. При чем предполагается, что конформация канального белка осциллирует и тем самым облегчается связывание транспортируемого иона и прохождение его через канал.

Рис 2 Схема белка образующего калиевый канал, погруженный в бислой плазматической мембраны.

Потенциал - зависимый патриевый канал

Ионные каналы другого типа обеспечивают транспорт ионов при наличии эффекторного воздействия. К таким каналам относятся потенциал - зависимые натриевые каналы, участвующие в генерации и распространении потенциала действия в нервной системе и рецептор - зависимые каналы синапсов.

На (рис 2, 3, 4) представлена схема потенциал - зависимого натриевого канала и его состояние при возбуждении.

Рис. 3 Схема белка образующего натриевый канал в состоянии покоя

 

Рис.4 Схема белка образующего натриевый канал при возбуждении – деполяризация мембраны

 

Рис.5 Схема белка образующего натриевый канал при возбуждении – деполяризация – реполяризация мембраны

 

Натриевые каналы активируются (т. е. открываются и пропускают ионы) в ответ на деполяризацию мембраны, при этом они проявляют высоко избирательную проницаемость для Li⁺ и Na⁺ по сравнению с другими ионами. Такое свойство обусловлено особой структурой каналов, благодаря которой они играют роль избирательных (селективных) фильтров. Поскольку в норме ионы лития в организме практически отсутствуют, весь ток, проходящий через эти каналы, переносится ионами Na ⁺; ионы же Са₂⁺ и К⁺ через них почти не проходят.

Процессы, приводящие к открыванию или за­крыванию каналов, описывают ворот­ными механизмами.

В покое натриевый канал механически перекрыт некой заряженной структу­рой (рис.3). При деполяризации мембраны конформация этой структуры изменяется, и канал открывается (рис.4). Главный аргумент в пользу того, что в мембране действительно проис­ходят подобные механические конформационные перестройки, - это регистрация так называемых воротных токов, возникающих при открывании и за­крывании натриевых каналов. Эти очень слабые токи можно обнаружить, если активировать натриевые каналы, предварительно заблокировав их с помощью фармакологических препаратов с тем, чтобы через них не мог протекать мощный ионный ток. Полагают, что воротные токи связаны с перемещением заряженных группировок, приводящим к открыванию активационных ворот (m-ворот) при активации каналов.

Здесь может возникнуть вопрос, каким же обра­зом деполяризация мембраны приводит к откры­ванию потенциал - зависимых каналов? Представим себе типичную возбуди­мую клетку в состоянии покоя. Ее мембранный потенциал составляет — 75 мВ. Деполяризация на 50 мВ (т. е. до — 25 мВ) обычно приводит к активации большей части натриевых каналов, расположенных в мембране. Эти каналы представляют собой моле­кулы белка, вкрапленные в мембранный липидный бислой толщиной порядка 5 нм. Значит, при деполя­ризации на 50 мВ в этом бислое (а следовательно, и в расположенных в нем воротных белках) возни­кает изменение напряжения 10~3 В на 10 ~8 см, т.е. 100000 В/см. Неудивительно, что заряженные груп­пировки белков-каналов «чувствуют» такие измене­ния напряженности поля и отвечают на них конформационными пере­стройками каких-то участков белковых молекул.

Считают, что эти конформационные перестройки и лежат в основе воротных процессов, управляющих электровозбудимыми каналами.

При длительной деполяризации натриевые кана­лы инактивируются. Инактивация развивается в мембране автоматически, и степень ее зависит от мембранного потенциала и времени. Постоянная времени инактивации составляет менее 2 мс. Инактивацию можно подавить, введя в ци­топлазму протеолитические ферменты. Это позво­ляет думать, что в инактивации принимает участие некая белковая структура, расположенная у внут­реннего входа натриевого канала - инактивационных ворот (h-ворот). h-Ворота закрываются через не­сколько миллисекунд после открывания m-ворот (рис.5). По-видимому, закрывание h-ворот зависит от пребывания m-ворот в открытом состоянии.

Тетродотоксин (ТТХ) - вещество, выделенное из внутренних органов иглобрюха (рыбы, обитающей у берегов Японии), способен внедряться в натриевые каналы и блокировать их. Опыты, прове­денные на различных видах нервов, показали, что натриевые каналы на участке мембраны аксона площадью 1 мкм² связывают менее 100 молекул ТТХ. При этом полностью подавляется увеличение натриевой проводимости, возникающее в норме при деполяризации.

Кинетические особен­ности блокирования каналов свидетельствуют о том, что каждая молекула ТТХ связывается с одним натриевым каналом. Значит, число каналов на 1 мкм² мембраны составляет менее 100. Если бы все эти каналы открывались одновременно, то площадь их сечения должна была бы составлять менее 1 50000 от поверхности мембраны, если считать, что диаметр канала составляет порядка 0,5 нм. То, что на долю канала приходится столь малая часть поверхности мембраны, вполне согла­суется с моделями клеточных оболочек Даниелли и Сингера.

Согласно этим моделям, низкая проницаемость мембраны для полярных мо­лекул обусловлена тем, что большую ее часть зани­мает сплошной липидный бислой. Чрезвычайно ма­лая площадь канала объясняет также и то, почему при тех значительных изменениях проводимости,

которые наблюдаются при возбуждении мембран, не происходит каких-либо существенных изменений емкости мембраны.

В 1980г. Фредерик Сигворс и Эрвин Неер с по­мощью так называемого метода локальной фикса­ции (patch-clamp) смогли зарегистри­ровать ток через одиночный натриевый канал, ак­тивированный с помощью деполяризации.

 

Для это­го они использовали микропипетку диаметром 0,5 мкм, в кончик которой втягивали участок мем­браны для создания тесного контакта между пи­петкой и мембраной. Оказалось, что токи через одиночные каналы подчиняются закону «все или ничего», имеют прямоугольную форму (это сви­детельствует об очень быстром открывании и за­крывании каналов) и одинаковы по величине для разных каналов. При этом длитель­ность пребывания каналов в открытом состоянии варьирует случайным образом и довольно широко. Среднее время нахождения канала в открытом со­стоянии составляет менее 1 мс и зависит от мем­бранного потенциала: при смещении деполяризующего потенциала в положительную сторону это время уменьшается. В то же время проводимость одиночных натриевых каналов слабо зависит от напряжения и равна примерно 10 пСм (что соответствует сопротивлению 10¹¹ Ом). Используя закон Ома, постоянную Фарадея и число Авогадро, находим, что при V_м — E_Na = -100 мВ (примерно такова электродви­жущая сила для Na⁺ в начале развития ПД) активи­рованные натриевые каналы пропускают примерно 6000 ионов натрия за 1 мс.

Число каналов, открытых в каж­дый момент времени, зависит от мембранного по­тенциала, а также от времени, поскольку от времени зависят процессы, приводящие к активации и инак­тивации каналов.

Таким образом, суммарные, за­висящие от потенциала и времени изменения на­триевой проводимости мембраны по­рождаются воротными процессами в тысячах на­триевых каналов, каждый из которых в ответ на деполяризацию открывается и закрывается в соот­ветствии с определенными

вероятностными зако­номерностями