Здоровые Больные шизофренией

Рис. 2. Пропорция меченых клеток в ФГА-стимулированных культурах лимфоцитов крови здоровх и больных шизофренией. 3Н-тимидин вводился в культуру на 1 час на 3 день культивирования.

Рис. 3а. Кинетика включения 3Н-тимидина в ФГА-стимулированные лимфоциты здоровых. 3Н-тимидин вводился в культуру на 1 час на 1, 2, 3, 4, 5 и 6 день культивирования.

Рис. 3б. Кинетика включения 3Н-тимидина в ФГА-стимулированные лимфоциты больных шизофренией. 3Н-тимидин вводился в культуру на 1 час на 1, 2, 3, 4, 5 и 6 день культивирования.

Таким образом, данные, полученные нами, позволяют сделать предположение, что антимозговые антитела в сыворотке крови больных шизофренией направлены преимущественно к антигену а2-гликопротеину. Однако для того, чтобы полностью подтвердить это предположение, необходимо провести изучение индивидуальных гликопротеинов фракции 10 и/или гликопротеиновой фракции, связывающей конканавалин А.

Изучение лимфоцитов периферической крови больных шизофренией позволило получить следующие результаты. Рис. 2 демонстрирует включение меченого по тритию тимидина в ДНК клетки стимулированных фитогемагглютинином (ФГА) лимфоцитов крови. Как можно видеть на рисунке 2, пропорцию меченых клеток в культуре лимфоцитов крови здоровых после добавления ФГА составляла 40,9 %. Функциональная активность лимфоцитов крови больных шизофренией была значительно снижена и составляла в среднем 27,2 %. Сниженная реакция лимфоцитов крови на ФГА выявлялась у 68 % больных.

Дальнейшие исследования продемонстрировали, что сниженная реакция лимфоцитов периферической крови на ФГА обусловливалась по меньшей мере 2 факторами: 1) удлинением митотического цикла, о чем свидетельствует задержка на 1 день максимального ответа (пика митотического индекса) у больных шизофренией по сравнению с таковым у здоровых (Рис. За, б) и 2) снижением величины пролиферативного пула лимфоцитов у больных шизофренией, что демонстрируется на рис. 4.

Рис. 4. Пропорция меченых клеток в различные часы в условиях насыщения 3Н-тимидином в ФГА-стимулированных лимфоцитов в культуре здоровых и больных шизофренией

Известно, что, если культура клеток состоит из единой популяции пролиферирующих клеток (без резерва клеток отдыхающих), все клетки должны пометаться, если тритиевый тимидин вводить в культуру постоянно в течение периода времени, который больше, чем время генерации. В течение этого времени все клетки должны пройти или войти в фазу синтеза ДНК и поэтому включить метку. Если, с другой стороны, не все клетки проходят цикл деления, потому что может существовать дремлющая или отдыхающая популяция клеток в культуре процент меченых клеток достигнет плато на уровне, меньшем, чем 100 %.

Результаты изучения пролиферативного пула в стимулированных ФГА культурах лимфоцитов 2 здоровых и 2 больных шизофренией показаны на рис. 4. На основании полученных данных были построены кривые насыщения (зависимость пропорции меченых клеток от времени инкубации с тритиевым тимидином). Пролиферативный пул лимфоцитов 2 здоровых был равен 76 % и 63 %, а пролиферативный пул больных шизофренией — 31 % и 32 %.

Из этих данных очевидно, что ни у больных, ни у здоровых не было получено 100 % меченых клеток в культуре лимфоцитов, стимулированных ФГА, т. е. клетки во всех изученных культурах состояли по меньшей мере из 2 популяций клеток, одна из которых находилась в состоянии непрерывного цикла, а другая являлась дремлющим или отдыхающим резервом. Пропорция отдыхающих клеток в культурах лимфоцитов больных шизофренией была значительно больше.

Целью дальнейших исследований было изучить количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови больных шизофренией.

Использование иммунофлуоресцентного метода позволило продемонстрировать, что пропорция В-лимфоцитов у больных шизофренией значительно увеличена и составляет в среднем 44 % по сравнению с 22 % у здоровых (р<0,001) (рис.5). В тоже время число Т-лимфоцитов, способных к спонтанному розеткообразованию с бараньими эритроцитами, редуцировано. Дальнейший анализ различных форм розеток показал, что лимфоциты крови больных шизофренией формируют большое число так называемых неполных розеток, т. е. таких, при которых к лимфоциту присоединяется 4-7 эритроцитов барана (табл.3). В тоже самое время, число полных розеток типа морулы значительно снижено у больных шизофренией по сравнению с таковым у здоровых.

Следующие эксперименты (культивирование лимфоцитов здоровых в среде, содержащей сыворотку крови больных шизофренией) продемонстрировали, что сыворотка крови больных шизофренией содержит вещество, способное редуцировать число синтезирующих ДНК клеток в стимулированной ФГА культуре лимфоцитов здоровых (рис. б). Как можно видеть на рис. 6, число меченых клеток в культуре лимфоцитов здоровых значительной снижается после добавления в среду сыворотки крови больных шизофренией. В тоже самое время, число меченых клеток в культуре лимфоцитов больных шизофренией не изменяется после добавления в культуральную среду сыворотки крови здорового. Это вещество, способное ингибировать, содержится в сыворотке крови 81,2 % больных шизофренией. Сходные результаты были получены при использовании как авторадиографического метода, так и метода измерения тотальной радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике (рис.7).

Рис. 5. В-лимфоциты (иммуннофлуоресцентный метод).

Рис. 6. Ингибирующий эффект сыворотки крови больных шизофренией на уровень пролиферации ФГА-стимулированных лимфоцитов здоровых.

Таким образом, представленные выше исследования позволяют выделить три группы фактов: 1) выявление антител к мозговым белкам у больных шизофренией; 2) снижение функциональной активности Т-лимфоцитов периферической крови; 3) наличие в сыворотке крови больных шизофренией фактора, способного редуцировать реакцию лимфоцитов периферической крови здоровых на ФГА.

Антитела к Т-лимфоцитам очевидно могут быть одним из факторов, способных проявить такой Ингибирующий эффект. Эти антитела могут блокировать, разрушать и даже лизировать Т-лимфоциты, Данные об общих органоспецифических антигенах мозга и тимуса человека и целого ряда животных позволили нам предположить, что антитела к мозговым антигенам могут обладать и такими свойствами.

Таблица 3. Е-розеткообразование при шизофрении

Рис. 7. Ингибирующий эффект сыворотки крови больных шизофренией на уровень пролиферации ФГА-стимулированных лимфоцитов здоровых. А — сцинтиляционный счетчик. Б — авторадиография.

Рис. 8. Антитимическая активность сыворотки крови.

Рис. 9. Распределение больных шизофренией и здоровых в зависимости от уровня антитимической активности сыворотки крови.

Мы исследовали цитотоксический эффект сыворотки крови больных шизофренией и здоровых на тимоциты мышей СВА, основываясь на данных литературы и наших собственных данных, в которых было доказано существование общих антигенов в тимусе и мозге мышей и человека. Для того, чтобы изучить эти общие органоспецифические антигены мозга и тимуса человека и мыши, использовали кроличью антисыворотку тимоцитов человека, абсорбированную тканью мышиной печени и костного мозга. Было обнаружено, что та сыворотка обладала высокой цитотоксичностью по отношению к мышиным тимоцитам. Ткань мозга человека и тимоциты человека полностью абсорбировали цитотоксическую активность этой сыворотки по отношению к тимоцитам мыши. На основании этих данных мы сделали предположение, что мозг человека имеет антигены идентичные или очень близкие к таковым тимоцитов человека. Сходным образом цитотоксичность антисыворотки против тимоцитов человека полностью исчезала после абсорбции ее тканью мозга мыши и мышиными тимоцитами. Эти результаты демонстрируют наличие общих антигенов между тканями человека и мыши. На основании этих данных сделано заключение о возможности использования мышиных тимоцитов в цитотоксическом тесте при изучении сывороточных антител против человеческих тканей.

Анализ полученных данных позволил продемонстрировать, что сыворотка кропи как больных шизофренией, так и здоровых обладает цитотоксической активностью. Величина цитотоксического индекса, означающего данную активность, значительно колеблется в обеих изученных группах: от 0,0 до 0,85 у здоровых и от 0,0 до 0,97 у больных шизофренией. Однако средний уровень антитимической активности в группе больных шизофренией был значительно выше, чем таковой в группе здоровых: 0,52 и 0,26 соответственно (р<0,001) (рис.8). Дальнейший детальный анализ распределения индивидуумов с различным уровнем антитимической активности сыворотки крови в группах больных шизофренией и здоровых позволил нам предположить существование 2 или больше субпопуляций в обследованных группах (рис.9).

В соответствии с этим был проведен дальнейший анализ после распределения всех обследуемых в три группы в зависимости от уровня антитимической активности их сыворотки крови: первая — с низкой (от 0,0 до 0,26), вторая — со средней (от 0,27 до 0,55) и третья — с высокой (от 0,56 до 0,97) величиной цитотоксического индекса. Анализ распределения больных шизофренией и здоровых в этих трех группах показал, что в контрольной группе здоровых сыворотка крови 61,7 % индивидуумов обладала низкой антитимической активностью и только сыворотка крови 23,4 % индивидуумов обладала высокой антитимической активностью. В группе больных шизофренией ситуация была прямо противоположной: сыворотка крови 26,5 % индивидуумов обладала низкой антитимической активностью и сыворотка крови 53,1 % — высокой. Поскольку в группе больных шизофренией происходило накопление индивидуумов сыворотка крови которых обладает высокой антитимической активностью, средний уровень антитимической активности сыворотки крови в группе больных значительно превышает таковой в группе здоровых.

Однако дальнейшие исследования показали, что высокий уровень антитимической активности сыворотки крови характерен не только для шизофрении. Как можно видеть на рис. 10, сходный уровень антитимической активности был обнаружен в сыворотке крови больных маниакально-депрессивным психозом и больных с тиреотоксическим зобом. Величина цитотоксического индекса в этих группах была соответственно равна 0,54 и 0,51. Эти группы по уровню антитимической активности сыворотки крови статистически значимо (р<0,05) отличались от группы здоровых и не отличались от группы больных шизофренией. В противоположность этому уровень антитимической активности сыворотки крови больных с грыжей, острым аппендицитом и сенильной деменцией не отличался от такового в группе здоровых.

На основании серии биологических исследований, выполненных в Институте психиатрии Академии медицинских наук СССР, наиболее адекватной классификацией шизофрении очевидно является таковая, основанная на типе течения заболевания. В связи с этим уровень анти-тимической активности сыворотки крови был проанализирован в двух группах больных шизофренией: с непрерывным и шубообразным типом течения. Анализ показал, что нет четкой связи между уровнем антитимической активности сыворотки крови больных и клиническими особенностями течения шизофрении: уровень антитимической активности сыворотки крови был практически одинаковым в обеих группах больных (0,50 и 0,53 в группах с непрерывным и шубообразным типом течения соответственно. Тем не менее, так как уровень антитимической активности сыворотки крови значительной колебался в группе больных шизофренией, возник вопрос о том, не связано ли это колебание с другими клиническими параметрами заболевания и в особенности с длительностью течения болезни. Анализ продемонстрировал, что в группе больных с низкой сывороточной антитимической активностью 84 % индивидуумов болеют более 5 лет и лишь у 16 % индивидуумов заболевание длится менее 5 лет. Совершенно другая, картина выявляется в группе больных с высокой сывороточной антитимической активностью: у 57 % индивидуумов болезнь длится более 5 лет, а у 43 % — менее 5 лет. При сравнении распределений в этих двух группах мы получили статистически значимое различие (р<0,05). Другими словами, в начальный период заболевания происходит накопление лиц с

высоким уровнем антитимической активности сыворотки крови. Максимальная частота выявления сывороток с высоким уровнем антитимической активности наблюдается у больных с длительностью болезни меньше 5 лет. Можно сказать, что, чем длительнее заболевание, тем меньше выражена антитимическая активность сыворотки крови больного, и наоборот, чем короче шизофренический процесс, тем большая возможность, что сыворотка крови больного будет обладать высокой антитимической активностью.

Следующие исследования были направлены на изучение генетической детерминированности уровня антитимической активности сыворотки крови. Была изучена антитимическая активность сыворотки крови 44 родственников больных шизофренией.

Многократное тестирование уровня антитимической активности в сыворотке крови одного и того же больного показало незначительные колебания цитотоксического индекса. Вместе с тем, межиндивидуальные различия изучаемого параметра были выражены более значительно. При оценке этих результатов можно было предположить, что межиндивидуальные различия в относительно гомогенной группе частично детерминируются генетическими факторами.

Хорошо известно, что механизмы формирования аутоиммунного процесса контролируются полигенной системой. Принимая это во внимание, была сделана попытка проверить, соответствуют ли наши данные модели полигенного наследования с пороговой манифестацией. Рис. 11 показывает частоту распределения величины цитотоксического индекса в 3 основных группах: а) здоровых, б) больных шизофренией, в) родственников этих больных шизофренией. Из представленного графика очевидно (и подтверждено статистическим анализом), что все 3 распределения значительно отклоняются от нормального Гауссовского распределения, которое обычно ожидается при полигенной модели. Тем не менее, используя приблизительную формулу отклонения Edwards, мы попытались определить наследуемость величины цитотоксического индекса путем подбора различных пороговых уровней этого параметра с интервалом стандартного отклонения 0,5—2,5 более высоким, чем средний уровень его для здоровых. Рис. 12 показывает теоретическое распределение для полигенной модели в общей популяции и в популяции родственников пробандов с данным признаком. Пороговые значения, ниже которых лежат все лица, манифестирующие данный признак лежат в правой стороне распределения.

Рис. 10. Антитимическая активность сыворотки крови.

Рис. 11. Распределение лиц с разным уровнем антитимической активности сыворотки крови в группах обследованных.

Рис. 12. Модель полигенного наследования. Вертикальная черта — порог.

Рис. 13. Возможная модель моногенного наследования.

Мы обнаружили, что даже при самом экстремальном пороговом уровне, ниже которого нет здоровых лиц, пропорция родственников, превышающих порог, еще очень большая (приблизительно 75 %).

Таким образом, коэффициент наследуемости превышает 100 %. Эти результаты не соответствуют пороговой (полигенной) модели. Тот факт, что при сравнении с общей популяцией наследственное отягощение для цитотоксической активности является достаточно высоким, предполагает возможность моногенного контроля продукции антитимических антител. Вплоть до настоящего времени мы изучали выборку семей, для которых мы имели данные, касающиеся родителей и сибсов наших пробандов. Данные для некоторых из этих семей представлены на рис. 13. Представленные данные можно интерпретировать в рамках моногенной модели с 3 аллелями и 6 соответствующими генотипами.

Это можно принять в расчет в большей степени по причине большой межиндивидуальной изменчивости величины цитотоксического индекса среди больных с функциональными психозами. Представленные семейные данные не противоречат этой гипотезе.

На сравнительно небольшом семейном материале была сделана еще одна попытка количественно оценить вклад генетических факторов в детерминацию межиндивидуальных различий уровня антитимической активности сыворотки крови. Мы рассматриваем это как предварительную попытку. Для этого мы использовали данные, полученные при обследовании 31 пары родитель — пробанд.

На этой выборке коэффициент корреляции (г) был равен 0,35. На сходном материале для выборки 24 супружеских пар (родители пробанда) коэффициент корреляции (г) был равен 0,003, что означало практическое отсутствие корреляции. Таким образом, нет оснований для проведения специальной коррекции корреляции «родитель-ребенок» для возможной первичной или вторичной брачной ассортативности. В соответствии с формулой коэффициента наследуемости в «узком смысле» (h2=2r) возможный вклад генетических факторов может быть оценен как 0,70, обусловленный только аддитивным взаимодействием аллелей. Это скорее высокая оценка, берущая в расчет тот факт, что невозможно исключить вклад различных нелинейных генетических факторов: доминирования и эпистаза. Для этого вклада дополнительные указания могут быть получены из характера популяционных распределений в уровне цитотоксического индекса в выборках родителей и их родственников в группе нормальных индивидов. Отсюда мы должны допустить, что изученный признак скорее строго детерминирован генетическими факторами.

Фактически, обсужденный выше генетический локус является только одним из нескольких локусов вовлеченных в сложную олигогенную систему, контролирующую предрасположение к заболеванию шизофренического спектра. Очевидно, наш семейный материал недостаточен, и обсужденная выше модель нуждается в более веском доказательстве этой гипотезы.

Следующие результаты служат другим примером значительной межсемейной изменчивости при шизофрении. Речь идет о том, что частота обнаружения антител против ткани мозга у родственников составляет 46,6 % в случаях, когда пробанды обладали сходными антителами. В противоположность этому такие антитела могли быть обнаружены только у 3,2 % родственников пробандов, у которых не было антител. Это было сходно с частотой в контрольной группе.

Число митотических и бластных клеток в ФГА-стимулированных культурах лимфоцитов также контролируется генетическими факторами. Это было доказано на близнецовой модели. Межпарные сравнения нормальных близнецов не показали значимых различий между МЗ и ДЗ близнецами. В то же время по сходным критерии в близнецовых парах больных шизофренией продемонстрированы значимые различия между МЗ и ДЗ близнецами.