МОРФОЛОГИЧЕСКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ

ГЛАВА 5

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И УРОВНИ КЛЕТОЧНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОКАРИОТ

Для эволюции прокариотных организмов характерен ярко выраженный физиолого-биохимический уклон, т. е. основное развитие прокариот шло по линии формирования и опробова­ния различных функций, результатом чего и явилось сегодняш­нее многообразие типов жизни в микромире. Поразительное физиологическое разнообразие прокариот сформировано на ба­зе весьма ограниченного числа морфологических форм. Дейст­вительно, морфологическая эволюция прокариот прошла не­значительный путь, так что мы можем говорить лишь о зачат­ках морфологической дифференцировки на базе прокариотной.клеточной организации. Относительно «продвинутыми» в этом направлении оказались только эубактерий. Для архебактерий характерно отсутствие сложных морфологических форм и ка­кой-либо клеточной дифференцировки.

Вегетативные клетки многих эубактерий в определенных ус­ловиях дают начало структурам, морфологически отличающим­ся от исходных. Ими могут быть вегетативные клетки, но изме­ненной формы, клеточные структуры с четко выраженной функ­циональной специализацией, различные многоклеточные обра­зования. В подавляющем большинстве случаев все известные проявления морфологической дифференцировки эубактерий на­правлены на повышение их выживаемости. Это выражается как в формировании специальных клеток, обладающих повышенной устойчивостью к перенесению неблагоприятных условий (эндос­поры, цисты), так и в формировании структур, обеспечивающих

эффективное размножение вида (гормогонии и баеоциты циа-|нобактерий).

В основе морфологической дифференцировки лежат опреде­ленные биохимические процессы, которые в свою очередь явля­ются выражением соответствующей генетической информации ¹³. Последняя запрограммирована в генетическом аппарате клетки и реализуется в процессе ее развития или же в зависимости от действия различных внешних факторов.

МОРФОЛОГИЧЕСКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ

Образование морфологически дифференцированных клеток у разных представителей эубактерий суммировано в табл. 6. Боль­шинство таких структур относится к категории покоящихся форм, назначение которых — обеспечить переживание вида в течение длительного времени в неблагоприятных условиях. Это

Таблица 6 Морфологически дифференцированные клетки эубактерий

 

Специализированные клетки	Представители эубактерий, | у которых они обнаружены
Эндоспоры	Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, некоторые актиномицеты
Экзоспоры	некоторые виды Methylosinus, Rhodo-microbium, многие актиномицеты
Цисты	миксобактерии, скользящие бактерии, Azotobacter, Bdellovibrio
Бактероиды	клубеньковые бактерии
Гетероцисты, акинеты, баеоциты, гормогонии	цианобактерии

эндоспоры ряда грамположительных бактерий, цисты азотобак­тера и миксобактерии, акинеты цианобактерии, экзоспоры от­дельных представителей метилотрофных и фототрофных бакте­рий, экзо- и эндоспоры актиномицетов. После попадания в под­ходящие условия покоящиеся формы прорастают, давая начало вегетативным клеткам. Другие морфологически дифференциро­ванные клетки служат для размножения. К ним относятся, на­пример, гормогонии и баеоциты цианобактерии. Наконец, тре­тьи (гетероцисты цианобактерии, бактероиды клубеньковых бак­терий) связаны с осуществлением уникального процесса, свой­ственного только прокариотным организмам, — фиксацией мо­лекулярного азота атмосферы.

¹³ Ф. Жакоб (F. Jacob) и Ж. Моно (J. Monod) определили дифферен-Цировку следующим образом: «одну клетку следует считать дифференци­рованной по сравнению с другой, если при одинаковых геномах набор белков, синтезированных в этих клетках, различен».

3 Микробиология

 

Мы рассмотрим случаи морфологической дифференцировки у эубактерий на примерах формирования ими разных типов по коящихся клеток. Сведения о других типах клеточной дифферен цировки можно найти в разделах, посвященных краткой харак теристике различных групп прокариот.

ПОКОЯЩИЕСЯ КЛЕТКИ

Цисты встречаются у разных групп эубактерий: азотобакте­ра, спирохет, миксобактерий, риккетсий. У большинства миксо- закономерная стадия их жизненного цикла (рис. 21,Л). После

Рис. 21. Цикл развития и плодовые тела некоторых миксобактерий: А — цикл развития Myxococcus: 1 — активно размножающиеся вегета тивные клетки; 2 — скопление клеток, предшествующее образованию пло дового тела; 3 — плодовое тело; 4 — миксоспоры; Б — плодовые тела: 1 — Myxococcus; 2 — Chondromyces (no Schlegel, 1972)

ркончания стадии активного размножения клетки миксобактерий собираются вместе и образуют так называемые плодовые тела, представляющие собой массу слизи, в которую погружены клет ки, или весьма дифференцированные структуры, поднимающиеся над поверхностью субстрата на простых или разветвленных сте бельках (рис. 21, Б). Внутри плодовых тел клетки переходят в покоящееся состояние. У одних видов цисты могут морфологи чески не отличаться от вегетативных клеток, у других их обра зование сопровождается заметными морфологическими и струк турными изменениями: происходит утолщение стенки вегетатив-

-ной клетки, в результате чего формируются оптически плотные, р более сильно преломляющие свет, окруженные капсулой укоро­ченные палочки или сферические формы (рис. 22,Л). Образова­ние миксоспор сопровождается синтезом белка, так что сформи- рованная миксоспора содержит около 1/3 заново синтезированно- го белка. ДНК не синтезируется, а переходит из исходных ве- гетативных клеток. Генетический аппарат миксоспор может быть представлен тремя или четырьмя копиями хромосомы вегета-, тивной клетки. Цисты миксобактерий более устойчивы к нагре­ванию, высушиванию, различным физическим воздействиям, чем вегетативные клетки.

Рис. 22. Строение покоящихся форм прокариот: А — миксоспоры миксобактерий; Б — цисты азотобактера; В — акинеты цианобактерий; Г — эндоспоры; 1 — нуклеоид; 2 — цитоплазма; 3 — ЦПМ; 4 — клеточная стенка; 5 — капсула; 6 — гранулы запасных веществ; 7 — внутренние покровы (интина); 8 — внешние покровы (экзина); 9 — ти-лакоиды; 10 — чехол; 11 — внутренняя мембрана споры; 12 —■ наружная мембрана споры; 13 — кортекс; 14 — по­кровы споры, состоящие из нескольких слоев; 15 — экзоспо-риум (по Дуде, Пронину, 1981)

У азотобактера образование цист сопровождается изменени­ем морфологии клетки, потерей жгутиков и накоплением в ци­топлазме в больших количествах гранул поли-|3-оксимасляной кислоты; одновременно происходит синтез дополнительных кле­точных покровов: внешних (экзина) и внутренних (интина) по отношению к клеточной стенке (рис. 22,5), различающихся структурно и химическим составом.

Покоящимися клетками некоторых цианобактерий, облада­ющими повышенной устойчивостью к ряду неблагоприятных факторов (высушиванию, пониженным температурам), являют­ся акинеты. Они, как правило, заметно крупнее вегетативных клеток, имеют продолговатую или сферическую форму, гранули­рованное содержимое и толстую оболочку. Образование акинет происходит в период замедления роста и начинается с увели­чения клеточных размеров, при этом в цитоплазме происходит

накопление гранул запасных веществ (гликогеновых, полифос­фатных и особенно крупных цианофициновых), а также карбок-сисом. Одновременно происходит утолщение пептидогликаново-го слоя клеточной стенки и уплотнение слизистого чехла за счет отложения в нем электронно-плотного фибриллярного материа­ла полисахаридной природы (рис. 22, В). Оболочки акинет со­держат больше липидов и полисахаридов, а цитоплазма — мень­ше воды, чем вегетативные клетки. В цитоплазме при формиро­вании акинет отмечается увеличение содержания ДНК, рибосом, но уменьшение количества хлорофилла и фикобилиновых пиг­ментов. Тилакоиды образуют сложную сетчатую структуру. Ско­рость фотосинтеза в акинетах ниже, а дыхание выше, чем в ве­гетативных клетках. Прорастание акинет происходит иногда вскоре после их образования или только после перенесения в свежую питательную среду и может осуществляться двумя пу­тями: иногда в акинете на одном из полюсов формируется пора, через которую выходит проросток, или же прорастание проис­ходит в результате разрыва оболочки акинеты.

Образование эндоспор — процесс, имеющий место только в мире прокариот. Бактериальные эндоспоры — это особый тип покоящихся клеток грамположительных эубактерий, формиру­ющихся эндогенно, т. е. внутри цитоплазмы «материнской» клет­ки (спорангия), обладающих специфическими структурами (мно­гослойными белковыми покровами, наружной и внутренней мем­бранами, кортексом) и устойчивостью к высоким температурам и дозам радиации, летальным в норме для вегетативных кле­ток (рис. 22, Г). Эндоспорам свойственно также и особое фи­зическое состояние протопласта.

Таблица 7 Эубактерий, образующие эндоспоры (по Дуде, 1982)

Окраска Отношение

Род бактерии Форма вегетативных клегок _{п 0} рр_аМу _к кислороду

Bacillus палочковидная ± аэробы

Clostridium та же ± анаэробы

Desulfotomaculum » — то же

Sporoladpbacillus » + аэробы

Sulfobacillus » — то же

Sporosarcina сферическая + »

Thermoactinomyces ветвящиеся нити + *

Actinobifida та же + »

Sporospirillum спириллы — анаэробы

Oscillospira дисковидные клетки в трихомах — то же

К спорообразующим относится большое число эубактерий приблизительно из 15 родов, характеризующихся морфологиче­ским и физиологическим разнообразием (табл. 7). Среди них имеются палочковидные, сферические, мицелиальные формы,

Fusosporus спириллы — »

спириллы и нитчатые организмы. Все они имеют строение кле­точной стенки, характерное для таковой грамположительных эубактерий. Ни в одном случае не выявлена наружная липопро-теиновая мембрана, несмотря на то, что многие роды и виды спо-рообразующих бактерий не окрашиваются по Граму. По типу питания среди них обнаружены хемоорганогетеротрофы, факуль­тативные хемолитоавтотрофы и паразитические формы. Отно­шение к кислороду также разнообразно: часть спорообразую-щих форм представлена аэробами и факультативными анаэроба­ми, другая часть включает облигатных анаэробов — от аэрото­лерантных форм до высокочувствительных к О₂.

Лучше всего процесс спорообразования изучен у представи­телей родов Bacillus и Clostridium, хотя имеющиеся данные по­зволяют сделать вывод о принципиальной однотипности этого процесса у всех видов, образующих эндоспоры. В каждой бак­териальной клетке, как правило, формируется одна эндоспора ^и. Первым шагом к спорообразованию является изменение морфо­логии ядерного вещества вегетативной клетки, образующего тяж вдоль длинной оси спорулирующей клетки (рис. 23). Приблизи­тельно 1/3 тяжа затем отделяется и переходит в формирующую-. ся спору. У некоторых видов ядерный тяж образуется только на одном полюсе клетки, в его формировании участвует не весь генетический материал вегетативной клетки, и впоследствии ядерный тяж целиком переходит в формирующуюся спору. Би­ологический смысл формирования ядерного тяжа до сих пор ос­тается невыясненным.

Формирование споры начинается с того, что у одного из по­люсов клетки происходит уплотнение цитоплазмы, которая вме­сте с генетическим материалом, представляющим собой одну или несколько полностью решшцированных хромосом, обособляется от остального клеточного содержимого с помощью перегородки. Последняя формируется впячиванием внутрь клетки ЦПМ. Мем­брана нарастает от периферии к центру, где срастается, что при­водит к образованию споровой перегородки. Эта стадия фор­мирования споры напоминает клеточное деление путем образо­вания поперечной перегородки (см. рис. 20,Л). Следующий этап формирования споры — «обрастание» отсеченного участка клеточной цитоплазмы с ядерным материалом мембраной веге­тативной клетки, конечным результатом которого является об­разование проспоры — структуры, расположенной внутри ма­теринской клетки и полностью отделенной от нее двумя элемен­тарными мембранами: наружной и внутренней по отношению к проспоре.

Описанные выше этапы формирования споры (вплоть до об­разования проспоры) обратимы. Оказалось, что если к спору­лирующей культуре добавить антибиотик хлорамфеникол (ин-

образующая в клетке до 3—5 эн-

¹⁴ Описана анаэробная бактерия, доспор.

гибитор белкового синтеза и, следовательно, ингибитор синтеза мембранных белков), то можно остановить «обрастание» клеточ­ной мембраной отсеченного септой участка цитоплазмы, и про­цесс спорообразования превратится в процесс клеточного деле­ния. (Между двумя мембранами септы откладывается материал

Рис. 23. Формирование эндоспоры спорообразующими бак­териями:

/ — вегетативная клетка; // — инвагинация ЦПМ; /// — об­разование споровой перегородки (септы); IV — формирова­ние двойной мембранной системы образующейся проспоры; V — сформированная проспора; VI — формирование кор-текса; VII — формирование покровов споры; VIII ■ — лизис материнской клетки; IX — свободная зрелая спора; X — про­растание споры; / — нуклеоид; 2 — цитоплазма; 3 — ЦПМ; 4 — клеточная стенка; 5 — споровая перегородка; 6 — на­ружная мембрана споры; 7 — внутренняя мембрана споры; 5 — кортекс; 9 — покровы споры (по Дуде, 1974)

клеточной стенки.) После образования проспоры дальнейшие этапы спорообразования уже необратимы. Между наружным и внутренним мембранными слоями проспоры начинается форми­рование кортикального слоя (кортекса). Затем поверх наружной мембраны проспоры синтезируются споровые покровы состоя­щие из нескольких слоев, число, толщина и строение которых различны у разных видов спорообразующих бактерий. В фор-

мировании слоев споровых покровов принимает участие как на- ружная мембрана споры, так и протопласт материнской клетки. У многих бактерий поверх покровов споры формируется еще одна структура — экзоспориум, строение которого различно в зависимости от вида бактерий. Часто экзоспориум многослой-• ный, с характерной для каждого слоя тонкой структурой. Все слои, окружающие протопласт эндоспоры, находятся внутри ма­теринской клетки. На их долю приходится примерно половина сухого вещества споры. После сформирования споры происхо­дит разрушение (лизис) «материнской» клеточной стенки, и спора выходит в среду.

Спорообразование сопровождается активным синтезом бел-: ка. Белки эндоспор в отличие от белков вегетативных клеток бо­гаты цистеином и гидрофобными аминокислотами, с чем связы­вают устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов, Содержание ДНК в споре несколько ниже, чем в исходной ве­гетативной клетке, поскольку в спору переходит лишь часть ге-I нетического материала материнской клетки. Генетический ма-[ териал поступает в спору в виде полностью реплицированных I молекул ДНК. Споры некоторых видов содержат по 2 или 3 f копии хромосомы. Содержание РНК в спорах ниже, чем в ве­гетативных клетках, и РНК в значительной степени при споро­образовании синтезируется заново. Одним из характерных про­цессов, сопровождающих образование эндоспор, является нако­пление в них дипиколиновой кислоты и ионов кальция в экви-молярных количествах. Эти соединения образуют комплекс, ло­кализованный в сердцевине споры. Помимо Са²⁺ в эндоспорах обнаружено повышенное содержание других катионов (Mg²⁺, Мп²⁺, К⁺), с которыми связывают пребывание спор в состоянии покоя и их термоустойчивость.

Существенные отличия эндоспор от вегетативных клеток вы­являются при изучении химического состава отдельных споро­вых структур. Экзоспориум состоит из липидов и белков и, ве­роятно, выполняет функцию дополнительного барьера, защища­ющего спору от внешних воздействий, а также регулирующего проникновение в нее различных веществ. Однако никаких дан­ных, подтверждающих эти предположения, пока нет. Механи­ческое удаление экзоспориума не приводит к какому-либо пов­реждению спор. Они обнаруживают такую же способность к прорастанию, как и споры с неудаленным экзоспориумом.

Споровые покровы в основном состоят из белков и в неболь­шом количестве из липидов и гликолипидов. Белки покровов обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям и обеспечивают спорам защиту от действия литических фермен­тов, других повреждающих факторов, а также предохраняют спору от преждевременного прорастания. Оказалось, что споры Мутантов, лишенные покровов, прорастают сразу же после вы­хода из материнской клетки, даже если условия для последу­ющего роста неблагоприятны. Кортекс построен в основном из

молекул особого типа пептидогликана. При прорастании споры из части кортекса, прилегающей к внутренней споровой мембра­не, формируется клеточная стенка вегетативной клетки.

В отличие от эндоспор, образующихся внутри материнской клетки и окруженных двумя элементарными мембранами, экзо-споры бактерий из рода Methylosinus и R\hodomicrobium фор­мируются в результате отпочкования от одного из полюсов ма­теринской клетки. Образование экзоспор сопровождается уплот­нением и утолщением клеточной стенки. У экзоспор отсутствуют дипиколиновая кислота и характерные для эндоспор структуры (кортекс, экзоспориум).

У актиномицетов споры являются покоящимися клетками и одновременно репродуктивными структурами. По типу образо­вания они делятся на две группы — эндогенные и экзогенные. Эндогенное образование спор внутри цитоплазмы материнской гифы, обнаруженное у представителей родов Thermoaclinomyces и АсЫпоЬЩЫа, протекает аналогично описанному выше. У боль­шинства актиномицетов споры формируются экзогенно путем деления гифы перегородками на участки, каждый из которых представляет собой будущую спору. Экзоспоры большинства актиномицетов не содержат каких-либо дополнительных вну­тренних структур помимо тех, которые наблюдаются в вегета­тивной клетке. Стенка споры обычно значительно толще, чем стенка гифы, и в ней можно различить несколько слоев раз­ной электронной плотности. Часто клеточная стенка окружена дополнительными наружными покровами.

Покоящиеся клетки эубактерии характеризуются низкими уровнями метаболической активности. В первую очередь это ка­сается дыхания. От степени снижения метаболической активно­сти зависит длительность сохранения жизнеспособности покоя­щихся клеток. Большой интерес представляет выяснение меха­низмов, ответственных за поддержание специализированных кле­ток в состоянии покоя. В настоящее время наибольшее внимание привлекают три гипотезы. Первая основана на том, что в поко­ящихся клетках имеются вещества, ингибирующие ферменты и, следовательно, блокирующие метаболизм. Из спор некоторых бактерий действительно выделены вещества, предотвращающие прорастание спор. Согласно второй гипотезе сохранение покоя связывают со структурой спор, обеспечивающей поддержание ее сердцевины в обезвоженном состоянии. Наконец, поддержа­ние покоя объясняют особым состоянием ферментов. Изменения их конфигурации, приводящие к активированию ферментов, вы­водят покоящуюся клетку из этого состояния. Возможно, что поддержание специализированных клеток в состоянии покоя — результат совместного действия всех описанных выше механиз­мов.

Для всех покоящихся форм характерна повышенная по сравнению с вегетативными клетками устойчивость к действию разнообразных повреждающих факторов: высоких и низких

температур, обезвоживанию, высокой кислотности среды, ради­ации, механических воздействий и др. В наибольшей степени эта устойчивость проявляется у эндоспор. Механизмы устойчи­вости в настоящее время мало изучены. Для эндоспор основны­ми факторами, обеспечивающими их устойчивость к действию не­благоприятных условий среды, предположительно является на хождение споровой цитоплазмы в обезвоженном состоянии, тер­мостойкость споровых ферментов, а также наличие дипиколи-новой кислоты и большого количества двухвалентных катионов. Большой вклад в устойчивость спор вносят поверхностные струк­туры (мембраны, кортекс, покровы), механически защищающие содержимое споры от проникновения извне агрессивных веществ. Механизм устойчивости к неблагоприятным факторам, основан­ный на дегидратации клеточных структур, имеет место и у дру- гих покоящихся форм эубактерии, так как все они характеризу- татся пониженным содержанием воды сравнительно с вегета­тивными клетками.

Условия, способствующие образованию покоящихся клеток, до сих пор изучены недостаточно. К категории благоприятствую­щих факторов относится наличие или отсутствие определенных питательных веществ среды, температура, кислотность среды, условия аэрирования. Формированию цист у миксобактерий, например, способствует наличие в среде глицерина, аминокис­лот. Количество цист азотобактера возрастает при добавлении к среде р-оксимасляной кислоты и повышении концентрации двухвалентных катионов. В качестве факторов, индуцирующих формирование акинет цианобактерий, отмечена низкая темпера­тура, высушивание, отсутствие в среде связанного азота или, наоборот, увеличение содержания глутаминовой кислоты.

Помимо факторов внешней среды, в неодинаковой степени влияющих на формирование разных типов покоящихся клеток, обнаружены специфические вещества, основная функция кото­рых заключается в регулировании роста и развития эубактерии, в частности в индуцировании процессов формирования покоя­щихся клеток. Такие вещества могут выделяться в культураль-ную среду или накапливаться внутри клетки. Они были выделе­ны, и показана индукция ими спорообразования.

Сформированные покоящиеся клетки в течение разного вре­мени могут находиться в жизнеспособном состоянии (табл. 8) и прорастать в подходящих условиях с образованием активно метаболизирующих вегетативных клеток.

Для эндоспор процесс прорастания состоит из нескольких этапов: активации, инициации и вырастания. Как правило, эн­доспоры даже в благоприятных условиях могут не прорастать. Для этого их необходимо подвергнуть активации. Наиболее об­щим активирующим фактором является термообработка споро­вой суспензии. После этого споры приобретают способность про­растать, но для начала прорастания необходим химический «пус­ковой» механизм. В качестве веществ, инициирующих прораста-

Таблица 8 Устойчивость покоящихся форм аубактерий к экстремальным воздействиям (по Дуде, Пронину, 1981) Тип „пкоят„«-я Побеждающий фактор клеток зысокая температура высушивание Миксоспоры миксо- гибель 90% после выдер- гибель 50% после хранения бактерий живания при 50° в течение в течение 6 сут 20 мин Цисты азотобакте- 100%-я гибель после вы- 100%-я жизнеспособность ра держивания при 60° в те- при хранении в течение чение 15 мин 12 сут Акинеты цианобак- гибель 95% после выдер- 95%-я жизнеспособность пос-терий живания при 40° в течение ле хранения в течение 15мес 10 мин при 4° Эндоспоры некото- гибель 90% после выдер- жизнеспособность сохраня-рых эубактерий живания при 100° в тече- лась в течение приблизи-ние 11 мин тельно 1000 лет Эндоспоры актино- гибель 99% после выдер- жизнеспособность сохраня-мицетов живания при 75° в тече- лась в течение 14 лет ние 70 мин

ние эндоспор, наиболее эффективны углеводы, некоторые ами­нокислоты и неорганические ионы.

В целом прорастание — это процесс, сопровождающийся сложными физиологическими и биохимическими изменениями. Начинается он с интенсивного поглощения спорой воды и набуха­ния. На первом этапе прорастания происходит активация фер­ментов (и в первую очередь литических), резко возрастает дыхание, т. е. мобилизуется энергия, происходят изменения в химическом составе (из спор удаляется дипиколиновая кисло­та), идет активный синтез белка и РНК, но репликация ДНК начинается не сразу, а через 1—2 ч после начала прорастания споры. Прежде всего происходят процессы репарации повреж­дений ДНК, произошедших в период покоя споры. За время прорастания споры теряют до 1/3 первоначальной массы. По­следующие этапы состоят в разрушении кортекса, разрыве спо­ровых покровов, выходе сформировавшейся к этому времени структуры, называемой ростовой трубочкой, достраивании ею клеточной стенки и последующем делении сформированной ве­гетативной клетки (см. рис. 23).