-биосинтез РНК на матрице ДНК эт первая стадия реализац генетич инфы,в пр-се котор определённ участк нуклеотидн последоват днк переписываются в комплиментарн одноцепочечн молек рнк, в рез те трпанскрипции образ мРНК-кодир ак последовательн белков,трнк,ррнк,и др рнк выполн стуктурн,регуляторн,каталитические функц.основа транскрипц-фундаментальн принцип комплиментарности азотист основан(а-ту, г-ц) полинуклеотидн цепей днк и рнк,пр-с осущ с участ ферментов рнкполимераз и белков регуляторов транскрипции.рнк транскрибир с 1 цепи дуплексного геном, или с разн цепей днк(бактериофаг Т4),если гены перекрещиваются -матрицами молек рнк транскрибир в противопол направл служ 2 цепи днкв 1 области её молекулы(бактерифаг лямбда) синтез рнк на днк матр ведут рнкполимеразы(гр.нуклеотидилтрансфераз),субстрат -нуклеозид-5'-трифосфаты. Активны рнкполимер в присутст ион Mg2+,для связывания котор в молек есть консессуальная последоват из 10 ак остатков.,рнкполим не нужд в праймере,исп рибонуклеозид-3'-фосфаты (атф,гтф,цтф,утф).рост цепи рнкпроисх последоват присоедин рибонуклеозид5'фосфатов к 3'гидроксильн группе рибозы предшеств нуклеотида.последоват определ комплиментарн взаимод азот основан.исп для ситеза рибонуклеотидов с аз основ матричн цепи днк,у бактер 1 фермент синтезир все виды рнк,у эукар-разн виды рнк синтезир разн рнкполимераз.У всех пр-су транскрипц подверг не вся молек днк а части(транскриптоны)ограниченные 2 последовательностями(промотер-зона начала, терминатор-остановка транскр), транскриптоны бактерий(опероны- вкл в себя нуклеотид последоват кодир структур нескольк генов(цистроны,структур гены)синтезир на оперон мрнк явл полицистроновой и использ для синтез нескольк белков,в отлич от моноцистроновой мрнк высш организм)интенсивн транскрипц завис от пространств структур днк(изгиб,петли(домены),сверхспирализов участки)-часто усилив транскрипц,тк создают дополнит возможн для присоед к днк разнообр белков-регулятор транскрипц.онс связываются с определ нуклеотид послед днк(энхансеры-усилти и адапторные элементы),наход в транскриптонах и др близких областях.белки-регуляторы приобрет или утрачив активность в рез-те модификац вызываемых катализаторами-белками-ферментами,либо в-вами небелков природы модулирующ их регуляторные св-ва.У примитивных форм жизни в регул транскрипц участв клеточн метаболиты-углевод,ак,нуклеотид идр)у эукариот транскрипц непосредств связ с изменен структуры хроматина(белков-нуклеиновый комплекс в котором пребывают их днк),переход хроматина в транскрибируем форму =дополнительный элемент регуляции транскрипц у высш орг.
15.Транскрипции у эукариот.
Синтез рнк у эукар осуш 3фермента — рнкполимеразы123,идентифицир по чуствительн их к амонотину(=А(ядовит в бледн поганк), рнкполимераз1 -не чуствит к А,синтезир большие рибосомальн рнк, рнкпол2 -наиболее чуствит к А,транскрибирует гены кодирующ белки и гены малых ядерн рнк, рнкпол 3-синтез рибосомальн транспортн рнк./рнкполимераз эукар неспособн самост связыв с промоутерами транскрибир ими генов,для присоедин им необходимы белков факторы транскрипци(TFфакторы 123 соответственно)-присоед в различн местах от начал транскриц. У различ видов эук выявл спецефич последоват в днк(=гомеобокс),длиной 180 нуклеотидн пар,в тех генах котор участв в регуляц диференцир и развития. Гомеотипические гены определ план морфологич строениянасекомого (-участв в диференцировк зародыша),если мутация -у мушек вместо антен мог вырасти ноги. В составе кодир этим генами белков есть гомеодоменыиз 60 ак остатков,связыв с днк,благодаря структур элем «спираль-петля-спираль»и большого колва остатков аргенина и лизина,для связывания с днк белков факторы транскрипц использ «цинковые пальцы». Многие факторы транскрипц содержат структур элемент «лейциновая молния»(протяжённые альфаспирали обогащён остатк лейцина+ домен с положит заряж ак остатками)-взаимод с днк в виде димеров., непосредст контакт с днк осущ здесь +заряж акостатки, а лейциновые участки- для стабилизации структуры димера. Разнообраз белковых факторов транскрипц(татабокс,энхансеры-усил,сайленсоры-глушитель,адапторные элементы) у эук связ с разнообраз регуляторных последовательностей свойствен ген высш организм-воздейств на транскрипцию этих элементов осущ через регуляторн белки(активир-подавляют транскрипцию,различными механизмами)
16. Регуляция транскрипции у эукар. - на рег транск у эук оказ влиян упаковка днк в составе хроматина(комплекс днк с белками(гистонами и негисоновыми элем)-обеспеч компактную упаковку молек днк в ядрах клеток).Хроматин напомин бусы,бусина — октамер гистонов(«нуклеосомный кор») гистоны помог днк организовываться в структур единиц- нуклеосомы(хромосомы)!вокруг октамера коровых гистонов обвит участок спирали днк длиной 145нуклеотид пар,соверш пир этом 1 ¾ оборота,и образует сверхспираль. Цепоцка нуклеосом(нитка бус) имеющ d=11нм, может конденсироваться с образов фибриллы тольщин 30 нмв которесть промежутки с неплотно упаков днк,-в этих местах к днк присоед негистонов белки хроматина(из группы сайт-спецефических днк связывающ белков узнающ особ последовательности в днк). За 30нм фибриллами в хроматине наблюд более высокие уровни конденсации- петельные домены,гигантские петлисуперспирализов днк(конденсированный хроматин),метафазные хромосомы.Компактизац днк у эукар предст собой способ контроля активности генов.тк характер укладки влияет на транскрипцион актив генома. Хроматин -1конденсированныйгетерохроматин, менеекомпактный но с более высок активностью- эухроматин. На экспрессию генетич материал мог оказыв воздейств крупномаштаб изменен в геноме — диминуция хроматина.(обнаруж вперв у нематод-паразит кишечн)-сост в эльминации значит части хроматина на ранних стад делен в оплодотвор яйцеклетк,в рез те разн типы клеток приобрет разн по структуре хромосоми разн возможн экспресси ген материал.-итог механизм выключения генов путём их удален из геномов соматич клеток./При активац эукариот генов происх избирательн деконденсация хроматина.коровые гистоны — участв в регуляц инициации транккрипц. Фосфорелирование гистонов так же путь активации транскрипции.
17.Процессинг РНК
-процесс просттранскрипционной модификации первичных транскриптов (рнк-предшественников). Спецефичен для ранзн вид рнк: А)процессинг матричн-рнк -этапы - 1сплайсинг- соедин концов вырезание из пре мрнк некодирующ областей-интронов, и сшивание кодирующ структур белка участков-экзонов, 2кэпирование -образован на 5'конце мрнк особ структуры-кэпа= «шапочки», 3 полиаденилирование — ферм поли(А)полимеразой-в итог образ на 3'конце олиго(А)фрагмента,содерж 100-200остатк адениловой к-ты= поли(А)хвост-опрнедел стабильностьмрнк и время её жизнив клетке.у эукар он способств выход мрнк из ядра в цитоплазм и оказ влиян на регул транскрипц м-рнк. Б)Процессинг трнк и ррнк — процэсинг у эукар затрагив все виды первичн транскриптов эукариотич ген, продукт транскрипц возник при участии рнк полимеразы 3 содерж интрон(вставка) вблизи антикодона. Вырезан этого интрона и лигирование(смешение) остальн частим молекулы предшественника приводит к образованзрелой т-рнк. Процеесинг р-рнк у высш орг соверш в ядрах клеток на базе молекул предшествнников, транскрибируемых с многочисл генов содерж в днк в виде тандемноповтор копий. В 1 первичн транскриптоне у млекопит коффициент сегментации 45S(=13 тыс нуклеотидов),содержится нуклеотид послед 18S(=2тыс нукл)28S(5 тыс нукл), 5,8S(160 нуклеотид рнк),котор делятся спэйсерными последовательностями. Эндонуклеазное расщепление этого предшественника идёт к выщеплению зрелых р-рнк и происх при участии малых ядерных рнк(мя-рнк)
18.Транскрипция у прокариот. Регуляц транскрипции. - биосинт рнк по матрице днк. Бактериальн полимеразы -сложн белки сост из нескольких субъединиц.у е.коли 5 промотеров(2 альфа, +бэта,бэта штрих, и W=коституционнфх субъединиц сост основу фермента=кор)β’-участвует в связывании фермента с ДНК, β-субъед участв впостроен полинуклеотид цепи рнк, α-субъед обеспеч правильн взаимодейств фермент с промоторами. кор+1субедин= хлорфермент рнк полимераза способн узнавать промотерн область в оперонах бактерий и инициир пр-с транскрипции. Узнаван промотеров происх после присоед к кор-фермет σ-фактора(после инициации транскрипц он отделяется) Элонгация и терминация осуществляется core-ферментом. Рнк полимераз раскручив 2цепоч молек днк с помощ особ днк раскруч сайта,вступ во взаимодейств с матрицейблагодаря наличию в структуре «цинковых пальцев»,раскруч до участка где происх синтез рнк и образ открытый комплекс,там возник рнк-днк спираль длин прим 20 нуклеотид, затем фермент вновь закручив днк позади участка полимеризац рнк и готов часть рнктранскрипта выводится из комплекса через особ канал. Скорость синтезарк у бактер сост 30 нуклеотид в сек.но может снижаться - «пауза транскрипц»для элонгации σ-фактор отдел от рнк полимеразы и замещается фактором элонгации.инициац транскрипц происх в зоне промотера.содерж старт сигал,там 2 концессуальные плследовательности=нематричная днк.открытие промотрера происх в точкетата бокса. И приводит к образован открыт комплкса и инициации.Терминация определ особ нуклеотид последоват в днк,расп в зоне терминатора стоп сигнал. Тут в образовавш рнк транскрипте происх образ элемента вторичн структуры — шпильки-наруш прочность гибридизац днк-рнк и вытесняет рнк полимеразу из комплекса.=итог высвобожден синтезир рнк, и восст двуспиральн структур днк.часть терминароров узнаётся лишь благодаря ро-фактору. Регуляция:рег в основном на стадии инициации и связ с деят регуляторн белков активаторов и репрессоров транскрипции.в пр се элонгации важн значен имеет вторичн структур синтезир рнк-от неё завис будут ли синтезир поноразмерн молек или коротк функцион непригодн транскрипты.рег транскрипц у бактер обычно охватыв груп генов кодир функциональн родственн белки,участв в осуществл тесно связ меж соб хим превращ в клетке.это обычно белки ферменты занятые метоболическим путём,ведущих к распаду или синтезу соединений. Оперон-груп согласованно регулируемых генов,кодир эти ферменты.Пр: лактозный оперон(негативн-юлокир действ рнкполимеразы при больш концентрац глюкозы и отсутств избытка лактозы, позитвная — индукция транскрипц при присоед к промотеру сомплекса сар-белка активир катоболитич опероны)и сАМРуниверс внутриклет регулят метоболитич пр-сов.), галактозный оперон триптофановый оперон.
19. Процессинг у прокариот.
В оснвн затрагив предшественники ррнк и трнк,а полицистонные мрнк использ для трансляции(биосинт белка) сразу после их синтеза на соответств оперонах бактерий даже до окончан транскрипции, и биосинт белка сопряжён с транскрипцией.полиА хвосты в отлич от эукар дестабилизируют структуру ряда мрнк бактер.процессинг необходим для образован зрел молек ррнк и трнк.первичн транскрипт содерж послед этих рнк образ на оперонах вкл гены 16S-,23s-, 5S-, -рнк и т-рнк.первич транскрипты так же содерж спейсеры-вставочн последовательн.,существенн для процессинга.вычлениение ррнк происх с участ эндонуклеаз,разрезающ первичные транскрипты в областях спайсеров. Методами ген инженерии получ активн в процессинге трнкгибридный фермент с пом котор можн сформир 5' и 3'конец т-рнк. Одновременно с процессингом рит рнк осуществл модифицирование ряда азотист основан привод к образован характер для трнкдигидроурацила,псевдоуридина,тимина.
20. Биосинтез белка. Генетич.код.
=трансляция-важн этап реализац генетич программы клет в пр-се котор инф закодир в первич структур нукл.к-т переводится в ак последовательность синтезируем белков. Перевод осушествл в соответст с правил генетич кода. Трансляц происх с участ специализир внутриклет структур-рибосом.В её осуществлен приним участие м,р,т-рнк и большая груп белковых факторов транскрипции.
Генетич.код. - 50г 20в Гамов предпол что ген код триплетен.Крик,Бреннер,Виттман установ код триплетен и непрерывен.Нирренберг,Очоа и Корана доказ 61 из 64 возможн сочетан 3ёх нуклеотид 4 типов кодир 1 из 20 протеиногенных ак,остальные 3 кодона из 64(УАА,УГА,УАГ) не кодир ни однук-ту.они явл сигналами остановки(терминац)трансляции и наз-ся стоп(терминирущими)-кодонами- не всегда однозначно распознаются сист трансляции и по этому в м-рнк дублируются.основным стопкодон УАА,на неб раст от него расп один из терминирующ триплетов УГА или УАГ. Тк число кодирующих триплетов 61 в 3 раз больш числа ак остатков,обычн присутств в белках,генетич код сильно вырожден. И мног ак кодир 2 и более кодонами только 2 ак Met, Trp кодир единичными кодонами- АУГ, УГГ. Вырожденность ген кода=для кажд ак существ более1 трнк, и 1 трнк может взаимод более чем с 1 кодоном мрнк.В 3буквенном коде наиб важн перв 2 букв,3-часто разная.(пр: глицин кодир синонимичн кодонами:гга,ггц,ггг,ггу) в связи с этим код назыв — квазидуплетным.эта особенность кодона позвол использ меньше трнк. Для взаимод с 61 кодон надо 31 трнк в цитоплазме и 22 в белоксинтезир системе митохондрий животн. Ген кодпочти всегда универсален(един для всех живущ на земле организм)
21. Биосинт белка Активация а к.
=трансляция-важн этап реализац генетич программы клет в пр-се котор инф закодир в первич структур нукл.к-т переводится в ак последовательность синтезируем белков. Перевод осушествл в соответст с правил генетич кода. Трансляц происх с участ специализир внутриклет структур-рибосом.В её осуществлен приним участие м,р,т-рнк и большая груп белковых факторов транскрипции.
Активац ак: перед нач трансляции сиинтезир в резте разнообр биохим реакц или получ с пищей протеиногенные ак должны пройти стадию активац и присоед к трнк, осуществл их доствку к рибосомам.во всех клетк есть набор трнк служащих адаптерами при переводе нуклеотид послед мрнк в ак послед белков.В структур трнк содерж нескольк функциональ важн участк(петель),главными из них для адаптерной функции- антикодон(служ для взаимод с соответст кодоном мрнк) и акцептирующий конец(нужен для присоед ак.располож на 3'конц молек трнк). Налич антикодон и акцептир функц позвол им выполнять адаптерную функц связыв и перенося ак остаток и присоед за счёт снтикодона к соответств кодону мрнк,они позвол ак остаткам выстраиваться в порядке диктуемым последоват нуклеотидов в матричн молек мрнк, и этим способств переводу последовательн нуклеотид в послед ак остатк синтезируемого белка в соотв с правил ген кода. Кажд трнк может переносить тольк 1 из ак вовлекаемых в биоситез белка. Для большей части ак имеется несколько трнк котор назся изоакцепторными — их существован связ с вырожденностью ген кода. В рез-те присоед ак к 3'концу молекулы трнк ак активируется,меж карбоксильн концом молек и концевым аденозином акцептирующего конца трнк возник макроэргическая связь, энергия от котор исп для синтез пептидной связи в ходе биосинтеза белка на рибосомах.в резте взаимод трнк и соответств ак возник аминоацилтрнк-содерж актив ак остаток и соответствующий антикодон и являющ истиным субстратом для реакц синтеза полипетид цепи белка.для кажд из ак существ особая аминоацилтрнк-синтетаза(фермент), котор осуществл спецефич узнаван и связыван ак и трнк в резте чего возникает аминоацилтрнк. Амамтрнксинтетазы облад исключит высок субстратн спецефичностью/+могут образовыв комплексы кодосомы в остав котор вход нескольк синтетаз и ферментов регулир их активность. После образован амацтрнк молекулы направляются в рибосомы. Где происх синтез белка! Рибос у бактер расп по всей протоплазме у эмбриона эукариот также свободн рибосом. +Определ число синтезир в ядре, митохондр,хлоропластах растен. Митохондриальн хромосом другие. В цитоплазм эукар содерж крупные 80S рибосомы с соотношением рнк-белок1:1,в их сост есть ионы Мg и Са,и небольш колво полиамина. Нуклеотид послед всех видов рнк у прокариот дешифрована и полностью изучена.
23.Биосинт белка этапы трансляци и.
=трансляция-важн этап реализац генетич программы клет в пр-се котор инф закодир в первич структур нукл.к-т переводится в ак последовательность синтезируем белков. Перевод осушествл в соответст с правил генетич кода. Трансляц происх с участ специализир внутриклет структур-рибосом.В её осуществлен приним участие м,р,т-рнк и большая груп белковых факторов транскрипции.
этапы: инициация(с пом белковых факторов иницIF1-связ инициаторной амоноацилтрнк, IF1,3-вероятн влияют на конфронтацию субчастиц), элонгация(обслуж 3 белков фактора ЕФ-ту,ЕФ-тс,ЕФ-ж, идёт в 3 этапа:1-образ условия для образ пептид связи меж ак остатк,2образ 1пептид связь в молек синтезир белка и возник дипептидил-трнк,3-транслокация-»шаг»рибосомы по мрнк от 5-к 3 концу происх на расстоян 1триплета в мрнк+все стадии многократн повторябтся полипептид цепь удлиняется), терминация(3 белов фактораRF1,2- распозн ненужн стопкодоны?(RF3 усилив работ 1,2) в мрнк-в рез те синтезир белок отдел от рибос а рибос диссоциир на 2 части).
22. Биосинт белка регуляц трансляци и.
=трансляция-важн этап реализац генетич программы клет в пр-се котор инф закодир в первич структур нукл.к-т переводится в ак последовательность синтезируем белков. Перевод осушествл в соответст с правил генетич кода. Трансляц происх с участ специализир внутриклет структур-рибосом.В её осуществлен приним участие м,р,т-рнк и большая груп белковых факторов транскрипции.
Регуляц трансляции:
Интенсивность и эффективн биосинт белковв клетк про и эукариот определ общими для всех типов клеток механизмами и спецефическими элементами контроля свойственными белок-синтезир сист эукариот. Перв этап регуляц транслц нач до нач биосинт белка на рибосомах и связ с деятельн аминоацил трнк синтетаз. В инициации у прокариот участв инициирующ последовательн мрнк + у про и эукар инициац может регулироваться изменен пространств структуры инициирующ участка мрнк-если свернётся во 2 или 3ичную структуру -блок инициац. Для продолж трансляц рибосома расплетает эту структур. Избирательн негативн регуляц достигается связыванием белк репрессоров инициир с мрнк. Регуляц синтеза рибосом белк идёт по простому элонгатному мех: репрессия синтеза белков наступает когда исчерпывается колво ррнк, неоходим для сборки рибосом. У эукар белком репресор мож выступать акониат гидратаза. Элонгация регулируется =это доказ «паузы» при прочтении рибосомами разных мрнк, задерживаются на минронных(присутств в мал колвах)кодонах изоакцепторных трнк(модулирующие кодоны)чем их больш тем медленнее., из зм неодинаковой доступности разн участк мрнк для рибосом, и из за деятельн особ регуляторн белков и малых рибонуклеопротеинов. У эукар есть белки репрессоры и инициаторы(3'нетранслир обл и полиАхвосты(стабилизир мрнк усилив инициац трансляц),последовательности называем сигналами полиплоэдирован и внутриклет локализац) трансляции. Маскирующие белки(связ с 3'нетранслир обл) делают мрнк недоступн для трансляц рибосом.дестабилизирующ белки способн вызв деградацию отдель видов мрнк, а аконитат-гидратаза наоборот стабилизир. Существ неспецефичные мрнк связыв белки универсальн взаимод со всеми мрнк,они формир в цитоплазм информосомы, связ со свободн мрнк и полисомами.
24.Репарация ДНК,виды,типы поврежд днк.
Передач наследств инф в неискажён виде — важн услов выжив организма и вида в целом.изменен в структур днк недопустимы,они ведут к мутац,блокир репликациюднк, гибель клеток. Днк подверг хим изменен в рез те воздействия уф облучен,темпират, спонтанных и индуцированных факторов среды.В ходе эволюц выработалась сист способная исправлять наруш в днк вызванные обибками репликации или повреждающми агентами среды. Это сист. Репарац. В рез те её активности на 1000 поврежден в днк только 1 приводит к мутации. Наруш в сист репарации мог привести к преждевремен старению, развит онкологии, болезням аутоимунной систем(повыш заболев раком с возрастом)
Виды поврежд днк: спонтанные -1.ошибки репликации в рез те появл некомплиментарн пары нуклеотидов,2-апуринизация-отщеплен азотист оснований от сахаро-фосфатностава-образован Арсайтов) 3-дезаминирование(отщепление аминогруппы от азотистого основания); индуцируемые — димеризация-сшивание соседних пиримидиновых оснований с образован димера) 2-размыкание пуринового кольца, однонитивые и двунитивые разрывы в днк, сшивки меж цепями днк.
Типы поврежден днк: поврежд одиночных нуклеотидов, повр пары нуклеотидов, разрыв цепей днк, образован поперечных сшивок меж основаниями 1 или различн цепей днк.
25. Репарация ДНК,её типы.
Передач наследств инф в неискажён виде — важн услов выжив организма и вида в целом.изменен в структур днк недопустимы,они ведут к мутац,блокир репликациюднк, гибель клеток. Днк подверг хим изменен в рез те воздействия уф облучен,темпират, спонтанных и индуцированных факторов среды.В ходе эволюц выработалась сист способная исправлять наруш в днк вызванные обибками репликации или повреждающми агентами среды. Это сист. Репарац. В рез те её активности на 1000 поврежден в днк только 1 приводит к мутации. Наруш в сист репарации мог привести к преждевремен старению, развит онкологии, болезням аутоимунной систем(повыш заболев раком с возрастом)
Типы репарации: 1 Прямая реп-наиб простой путь устранен поврежден в днк. задействованы спецефическ ферменты способн быстро устранять соответств повреждения восстанавлив исходную структуру нуклеотидов.
2. эксцизионная реп- удален поврежден азотист основан из днк и последующ восстановлен нормальн структуры молекулы.
26. Апоптоз — програмир клеточн смерть.(в отлич от некроза — случайн в рез те несчастно случ) Генетич запрогр. Активируется под влиян внешн или внутренних стимулов (вирусов, токсинов, клеточных онкогенов, днк поврежд агентов.) Пр. Листопад. Функция апопт: инструмент гомеостаза(поддерж постоян число клеток, их дифференцировки), оружие самозащиты организма от угрож ему и потомству опастностей. Обнаруж клет смерть можн на ранн этап эмбриогенеза при формир органов, замене 1 ткан на друг, и др прсах нормальн дифференцир и развития. Во взрослом сост участв в регуляц клеточн популяц(пр. для уничтож избытка лимфоцитов, после инфицирования), для илиминации клеток потерпевш генет поврежден или раковоперерождаются. Потеря контроля над апоптозом -патологич изменен в организме,(мож из за вирусов с антиапоптозной активностью) Вмолекуляр плане — многоэтапный процесс начин с приёма определ сигнала(на рецепторы апопт,восприним сигнал от индуктора стимулир прог клет смерти. Пр:рецепрор Fas+лиганд-запуск смерть клет инфиц вирус) и заканчив деструкцией клеточных молекул под действием литических ферментов(пр-протеаз, нуклеаз).4группы молек участв в апоптозе- каспазы(особ протеолитич ферменты),адаптерные белки(контролир активац каспаз),белки суперсемейства рецепторов некроза опухолей(ТNF) и и белк семейства Bcl-2/ В клетк подвергш апоптозу в мембран митохондр образ гиганск поры-разрыв. Апоптоз реализ с исп 2 систем:рецептор плазматич мембран, митохондриальн апотогенных факторов. При повреж днк апоптоз начин кпри накоплен белк р-53. Раковое перерожд клет связ с наруш сист апоптоза. При изуч Вич вир- белки вирус уссилив апопт. Т-лимфоцитов-истощ имун сист.
27. Методы генной инженери и.
= технолгия получен рекомбинантных днк. Ген инженер предст собой конструирование in virito функционально активных генетич структур(рек днк)=создание искусствен генетич прогр. (по АА Баеву) рожден генинжен 1972 г Берг и сотрудники.получили 1 рекоб днк(днквирусSV40+бактериофаг лямбдаdvgal. Благод генинж структур и функции любого гена и продукт его экспресс(рнк,белки) стали доступн для исслед.появ возможн изуч огромн геномов высш организм но и целенаправлен изменен их структуры, услов для создан генет трансформированных микроорг, растен, животн,способн стать продуцентами биол активн соединен(фермент гормон антибиот),-созд база для развит нов биотехнолог. Триумф в 20в. Методы исслед:1 .г ибридизац нуклеин к-т - благод связыв нкислот по принц комплиментарн(АТУ, ГЦ) позв выявить спецефич последоват днк и рнк,совмещать различ генетич элем.используется в цепной полимеразной р-и in virito,(сущ 2 метода.1-коннекторный метод созд услов для гибрид продуктов рестриктац разн геном путём наращ на их концах олигонуклеотидн участков их гибридиз ведёт к образ гибрид молек днк, исп 3 фермент- 5'эндонуклеаза, терминальн нуклеотидилтрансфераза,днклигаза(этим метпол 1 рекомбин днк) 2.рестриктазно-лигазный метод-(73г Коэн)более прост. Исп 1 рестриказу типа2, даёт фрагмент рестрикции с липкими концами,гибрид меж фрамент хромос и плазмидной днк осущ без процедур наращив комплиментарн концов. После оконч гибридизац остаётся сшить полинуклеотид фрагмент с помощ днклигаз) 2расщеплен днк (рестрикция с помощ рестриктаз-эндонуклеазы бактериаль происх,служ для защит клет бактер от чужеродн днк.осуществл разрывы фосфодиэфирных связ внутри полинуклеотид цеп днк. В ген инж рестрик исп для фрагментац молекднк при созд рекомбинат геномов)для выдел ген и манипуляций с ними. 3 .Клонирование дн к -осущ путём введен фрагментднк или их групп в быстро реплицир ген элементы(плазмиды вирусы) -возможность размножать гены в клетк бактер, дрожжей,эукар. Наиб часто размн в изуч штамах E.Coli.бактер мог приобр нов ген материал 3 путями- трансформацией (изм генотоип клетк внесен днк из культурн среды.стабильн измен генотип и фенотип клетк) коньюгацие й(прямой перенос днк из клетк донора в кл реципиент с исп белков мостика возник меж клетк), трансдукция (бактериофаги вводят в днк нов генет элем).+вектор-молек днк способн переносить в клетк чужерод днк и обеспеч её амплификацию 4. определен нуклеотидн последоват( секвенирование) в клонируемом фрагменте днк, позвол определить струкуру геномов и ак последовательность кодир ими белков(методы: 1химическ секвенир-максан,гилберт 76г-основ на спец хим модифик пурин и пиримидин основан с последующ выщеплением модифицирован нуклеотид из полимерн цепи и анализом образовавш продуктов методом гель-электрофореза. 2Энзиматическ мет- 75гсангер и коулсон, анализир фрагм днк исп в качве матрицы в реакции полимеразного копиров(синтез комплимент цепднк)с помощ днк полимеразы-1 E.Coli). 5.химико-ферментативный синтез полинуклеот идов, путь прямого получ необходим гена для технолог рекомб днк(см след вопр)
28. Химический синтез ген а(хим-ферментативн). - стал круп достид биоорганич хим мол биол, показал трудоёмкость эт раб,открыл путь прямого плуч необходим генов длятехнолог рекомбинантн днк, важн услов прогресс ген инженерии.
Вперв осуществл 1970г сша в лаборат ХГ Кораны. 1 ген- цистрон кодир дрожжев т-рнкala сост из 77 пар нуклеотид. Структур т-рнкala была расшифров и созданы приёмы органич синтеза, позволяющ синтезир 20 членныеолигонуклеотиды.снач осущ синтез коротких одноцепочечн олигонуклеотид, ступенчато присоед их один за другими с помощ днк-лигазы фага Т4.(+ферменты ортофосфатная групп в положен 5'на одном из сшиваем концов,олигонуклеотидкиназа фага Т4, фосфорелирующ групп 5'-ОН за счёт АТР) лигаза сшив фрагм днк на 1 цепи,а 2 цепь непрерывна. Нужн вводить синтезир нуклеотид попарно чтоб после взаимод комплиментарн област оставались концевые одноцепочечн участк=липкие концы.так образ получ крупн блоки олигонуклеотидов котор с пом днклигазы соедин в цел молек гена. Позднее были синтезир гены тирозинов супрессорн днк(207 нуклеотидов), гены гормонов инсулина, соматостатина.
Синтезир нуклеотид послед елого гена очч трудно,значит ценность предст синтез коротк участков 15-20 нуклеотид, исп в кач ве зондов гибридизации(исп в саузерн-нозерн-блоттинге,скрининге рекомбин кодон днк), в кач ве праймеров при определ нуклеотид послед по методу Сангера(анализ фрагмент днк исп в кач ве матрицы в р-и полимеразного копирования с пом полимераз1е.коли), синтетич сегменты-линкеры содерж сайты узнавания рестриктаз лигируют с фрагмент днк,встраиваемыми в векторы то значит облегчает манипулировн. С клонируемыми генами. Хим синтез полидезоксирибонуклеотидов в наст вр практически автоматизирован и проводится на установках «синтезаторах днк»
29. Перспект развит мол биол, получ биол актив соедин. Перспектив- переход к внеклет технологиям белкового синтеза.отказ от жив клет замен их «биореакторами» способ осущ избират синтез нужн белков,Сприн(делал биореакторы непрерыв действ с внеклет синтез белков) предл исп вкач ве исхож матер биотехнол биосинт белков рнк,для эт нужн быстр амплицировать индивид мрнк в бесклет сист(спомощ репликазыQбэта-быстр наращ кол во цепей рнк) рнк фага и бактер способн к рекомбинац с репликазQв, с направленным получ рекомбинативн рнк.= система мож осущ репликац,рекмбин, интенсив экспрессию в бесклет сист. Высокоочищ горм кальцитоцин и интерфероны получ с исп тольк определён мрнк.
Получ. Биол актив соед. Генети инженер открыл возможн конструир ген и легла в основу новых технолог получен биол актив соедин (гормон, рилизинг-факторы,регуляторн пептиды, интерфероны идр) тк мног из них содерж в биологич объект в ничтожных колвах и их выделен слишком трудоёмко или невозможн. Ген инженер преодолев эти трудности путём амплификации соответств генов, их клониров,экспрессии в клетк бактер и дрожж, в быстро реплицирующихся клетках многоклет организм, и этим добиваются получен значит колва физиол активн молек, пригодн для использов. Как мед препарат, пищ продукт итд. Одним из перв в ген инженерии был получ. С оматотропный гормон чел(г.роста) синтезир клетк гипофиза в норме.сост из 121 акостатк. Выделяют мрнк из клет гипофиза, осуществл синтез кднк, из неё выщепляли область кодирующ сигнальн пептид и вмест него встраивали триплет АТГ кодирующтметионин и служ сигнал нач трансляц. В белоксинтезир сист клет. К полученном гену присоединяли необходим для экспрессии регуляторные компаненты(промотер и лидирующ послед для присоед мрнк к рибосом) и включали эту конструкц в плазмиду,получали вектор молекуляр клониров.дальнейш трансформац,клониров этог вектора в бактериальн клетк. Там осущ интенсив репликация, транскрипц и трансляц -эт позвол получить необходим кол во гормона.-исп в медиц и животноводстве повыш интенсивн рост животн. Чтоб синтезир соматостати н(тормозит вычленен из гипофиз горм рост) пришлось обмануть внутриклет бактериальн протеазы(котор его разлагали) с помощью конструир химерного белка предшественника, после его выделения из клет бактерии его обрабатывали бромцианом и вычленяли соматостатин. Синтез инсулина(поджел.желез) - оч важен. Тк недост прив к диабет. В 78 г в сша хим синтез получ гены кодир ак послед зрелого гормона и осуществл их клонир а клетк E.coli. Но выход был незначителен. 1890 г из ткан чел выделили мрнкинсулина,82 г канада завершил работ по полному хим синтез гена проинсулина (у нас в 83 году), инсулин первый препарат врачебн практики создан с пом технолог рекомбинир днк. Бурн развитие привело к возникновен генно-индокринологии,(выдел релизинг фактор горм роста, кортикотропина соматокриниа-регулир рост животн) г-терапии(исправл наследств дефект путём введен в геном полноцен генов),успехи в получен биол активн пептидов.(лей-энкефалин), пептид гормон брадикинин,ангиотизин. Важен синт Интерферонов(альф(при возд на лейкоцит) бэта(пр воз на фибробласты) гамма(при возд бактер и вирусн антигенов сиинт в тлимфоцит ) -факторы препятсв размнож вирус в клетк. Был трудно выдел мрнк, но смогли копир все ген 3 вид интерферон, смогли получ встраив в е.коли. Так же в клетк дрожжей и высш эукар. Альф интерфер японц получ из крови гусен тутового шелкопряд.зараж вирус ядерн полиэдроза. Ген инженер исп в ген трансформац для получен клеток и цел организм животн.трансгенные животные- ввели чужие гены, част удача случайн характера.трудно регулир экспрессию генов(вст регуляторн промотеры), могут повыш рост и выход продукт питан, прод могут исп и в медицине, в животн можн выращ органы для трансплантации чел с ингибированием отторжения.+трасген раст(дальше)