Сложность азотного питания растений сводится к тому, что запасы доступных для них соединений этого элемента в почве незначительны. С урожаем зерновых ежегодно выносится из почвы 50 — 90 кг азота па каждые 10 ц зерна. Азотфиксаторы же создают естественное плодородие почвы, и человечество до появления химически связанного азота использовало лишь биологический азот.
В настоящее время азотфиксирующих микроорганизмов известно довольно много. Среди них есть и симбиотические, и свободпоживу-щие виды. Наибольшее же значение для повышения урожая сельскохозяйственных культур имеет использование клубеньковых бактерий. Азотфиксирующие микроорганизмы, образующие клубеньки на корнях бобовых, относят к родам Rhizobium и Bradirhizobium. Бактерии «узнают» своего хозяина (бобовое растение) по гликопротеииу — лектииу, расположенному на корневых волосках. При внедрении Rhizobium в корневые волоски образуются так называемые инфекционные нити, в которых находятся размножающиеся бактерии и которые проникают в кору корня и достигают тетраплоидиых клеток, после чего начинают формироваться клубеньки. В зрелом состоянии в последних на продольном срезе можно выделить четыре типа тканевой дифференциации: кора, меристема, сосудистая система и бактероидпая зона. Последняя занимает центральную часть клубенька, причем в начале его формирования клетки находятся в обычной форме, а затем образуют бактероиды, которые фиксируют молекулярный азот. Появление клубеньков происходит во время развития первых настоящих листьев (в том числе и у однолетних растений). Функционируют они недолго — некроз начинается во время цветения растения. Часть бактеро-идиых клеток лизируется, другая попадает в почву в виде мелких кокков. Фиксация молекулярного азота клубеньковыми бактериями ведет к образованию аммиака, из которого затем синтезируются аминокислоты. Этот процесс часто сопровождается выделением молекулярного водорода:
N2+ 8Н++ 8е + пАТФ ->2NH3+ H2+ пАДФ + пФ
Многие клубеньковые бактерии содержат гидрогеназу, которая катализирует окисление водорода, в результате чего происходит его рециклизация. В образовании из азота аммиака и водорода участвует питрогеиаза — фермент, состоящий из компонента I — молибдофер-редоксина (железомолибдеисодержащий белок) и из компонента II — азоферредоксина (железосодержащий белок).
Нитрогеназа образуется и активна лишь в анаэробных условиях, поэтому в клубеньках имеется железосодержащий пигмент — легге-моглобип, который обратимо связывает молекулярный кислород. В последние годы показана возможность фиксации азота и чистыми культурами некоторых азотфиксаторов в условиях низкого парциального давления кислорода.
Сразу после открытия явления симбиотрофиой фиксации молекулярного азота возникла мысль использовать ее для практических целей. Сначала для этого применяли почву, на которой выращивались бобовые культуры, ее разбрасывали на площадях для посева бобовых там, где они раньше не выращивались. Более эффективным оказалось собирание с их корней клубеньков, которые затем подсушивали и тонко размельчали. Таким материалом, с добавлением талька и бентонита, обрабатывали семена бобовых перед посевом.
В 1896 г. в Германии Ноббе и Гильтиер изготовили препарат, содержащий смесь клубеньковых бактерий, — нитрагин. В нашей стране в 30-х гг. XX в. такой препарат получали на торфе и называли ризоторфипом. Он наиболее эффективен при использовании под сою, люпин, люцерну, кормовые бобы. При этом наряду с увеличением урожая за счет существенного повышения содержания белка в растениях улучшается его качество. Процесс производства ризоторфииа включает следующие стадии.
A. Выращивание и храпение культуры клубеньковых бактерий.
Для этого используют растительные экстракты (отвары бобовых куль
тур), а также дополнительно обогащают сахарами (глюкозой, смесью
сахарозы с глюкозой) или маннитом. Пробирки со скошенным агаром
засевают соответствующим штаммом и выдерживают при 28 — 30 °С
от 4 до 10 сут. Выращенные культуры хранят в холодильнике (3 —
5°С).
Б. Получение жидкой культуры (инокулята). Оно происходит посредством культивирования в качалочных колбах или 5-литровых бутылях. При этом в первую емкость на 750 мл наливают 200 мл среды, а во вторую — 2 л. Бактериями с одного косяка засевают одну колбу, далее 3 — 5 % жидкой культуры, полученной в ней, засевается бутыль. Выращивают 48 — 96 ч. Выращенную культуру охлаждают до 10 — 15 °С и используют для инокуляции торфа.
B. Подготовка торфа. Для производства ризоторфина использу
ют преимущественно кислые или слабокислые торфа СрН 3,0 — 6,0),
предпочтительно древесно-осоковые и осоковые. Их очищают, высу
шивают (до влажности 25 — 30 %), размалывают (диаметр частиц —
0,1 мм), загружают в смеситель, увлажняют (до 35 — 40 % Н2О),
прибавляют мел (до рН 6,8 — 7,0), перемешивают и фасуют в пакеты
по 150 — 160 г, запаивают.
Г. Стерилизация. Облучение торфа гамма-излучением дозой 2,5 Мрад
обеспечивает практически полную стерильность субстрата-носителя. •>
Д. Инокуляция и хранение препарата. В стерильный пакет с тор-
фом вносят жидкий инокулюм клубеньковых бактерий. До инокуляции в жидкую культуру вводятся дополнительно стерильные растворы углеводов. Ииокулированные пакеты загружают во вращающийся барабан на 3 — 5 мин для перемешивания торфа с жидким инокулю-мом. Хранят при 5 — 15 °С (до б мес).
Применение ризоторфииа происходит таким образом:
1) осуществляется предпосевная обработка семян бобовых в день
посева (200 г/га на норму семян);
2) его суспендируют в соответствующем количестве воды, и этой
жидкостью обрабатывают семена;
3) суспензия бактерий вносится глубже расположения высевае
мых семян.