СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Получение биопрепаратов для защиты растений

Убытки сельского и лесного хозяйства от насекомых-вредителей ежегодно исчисляются в мире в 100 млрд дол. Развившаяся у них устойчивость к ядохимикатам привела к необходимости поиска но­вых эффективных средств борьбы. Оказалось перспективным исполь­зование собственных природных патогенов — микроорганизмов, вызы­вающих гибель насекомых-вредителей в их природных условиях. В на­стоящее время в различных странах мира производят более 30 микро­биологических энтомопатогенных препаратов. Они характеризуются высокой специфичностью поражения определенных видов насекомых и практически полной безвредностью для человека, теплокровных жи­вотных, птиц и полезных насекомых.

Энтомопатогенные препараты, получаемые на основе микроорга­низмов, выделенных в естественных условиях и внесенных туда вновь уже в виде микробных патогенов, не вызывают нежелательных изме­нений в биоценозах и не нарушают экологического состояния в реги­оне. Это делает их более перспективными по сравнению с традицион­но используемыми химическими инсектицидами.

Все микробные патогены выпускают в виде смачивающихся по­рошков или паст, реже дустов, гранул, инкапсулированных порошков, стабилизированной эмульсии спор и кристаллов. При непосредствен­ном применении различных форм препаратов предполагается исполь­зование различных добавок в виде растворителей, прилипателей, эмуль­гаторов, способствующих повышению их эффективности.

Создание бактериальных препаратов

Для защиты растений.

Работы по введению гена 5-эндотоксина

В геном растений

Среди всех промышленно выпускаемых микробных патогенов бактериальные препараты получили наибольшее распространение. Их отличают высокая вирулентность по отношению к насекомому-вреди­телю, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно вы­сокая скорость воздействия на вредителя и т. д. В мировой практике используются бактериальные энтомопатогенные препараты для борь­бы более чем со 160 видами вредных насекомых.

Из всех эитомопатогенных бактерий наиболее полно исследована с точки зрения применения грамположительиая бактерия Вас. thurin-giensis, которая помимо образования спор, вызывающих септицемию насекомого при попадании внутрь его тела, в ходе культивирования продуцирует ряд токсичных соединений, повышающих эффективность приготовленных на ее основе препаратов. Среди таких токсинов наи­более часто используется 8-эидотоксин. Чтобы насекомое погибло, кри­сталлы этого вещества должны попасть в его организм. После их по­глощения гусеницы прекращают питаться. При некоторых индивиду­альных различиях насекомых первичным местом действия 8-токсииа всегда является средний отдел кишечника. В зависимости от реакции на кристаллы все насекомые делятся па три группы, для которых ха­рактерны: 1) общий паралич; 2) паралич среднего отдела кишечника; 3) невосприимчивость к кристаллам, а реакция па весь препарат в целом. Большинство их относится к третьей группе: они погибают не от эндотоксина, а в результате прорастания спор и последующего размножения бактерий, приводящего к септицемии.

Способность Вас. thuringiensis образовывать различные токсиче­ские продукты, споры, кристаллы используется в промышленности при производстве на основе этого микроорганизма широкого круга раз­личных эитомопатогенных препаратов. Рассмотрим некоторые из них. Энтобактерин на основе Вас. thuringiensis var. galleriae выпускает­ся в виде порошка, жидкости в смеси с прилипателем и в виде пасты. Инсектин вырабатывается на основе спор и кристаллов Вас. thurin­giensis var. insectus. Алестин получают из спор и кристаллов Вас. thuringiensis var. alesti в виде порошка или стабилизированной пасты. Экзотоксин содержит культуральиую жидкость Вас. thurin­giensis var. insectus, имеет вид порошка, содержащего 3,3 % экзотокси­на. Токсобактерин производится на основе спор, кристаллов и экзо­токсина Вас. thuringiensis var insectus, выпускается в виде смачиваю­щегося порошка в смеси с прилипателем, содержит в 1 г 30 млрд спор и кристаллов и 0,025 г экзотоксина. Дендробациллин включает споры и кристаллы Вас. thuringiensis var. dendrolimus, употребляется в виде смачивающегося порошка, содержащего не менее 30 млрд спор в 1 г.

Битоксибациллин, или БТБ-202, готовится на основе спор и метабо­литов Вас. thuringiensis var. thuringiensis в виде порошка, содержа­щего в 1 г препарата 30 млрд спор и кристаллов.

Промышленное производство энтомопатогенных бактерий. Оно

предполагает глубинное культивирование с целью получения макси­мального титра клеток в культуральной жидкости и накопления ток­сина.

Все бактериальные энтомопатогенные препараты на основе Вас. thuringiensis производят по одной и той же технологической схеме. Ниже в качестве иллюстрации будет рассмотрена технология их по­лучения на примере энтобактерина. Она включает все стадии, типич­ные для любого микробиологического производства, основанного на глубинном способе выделения микроорганизмов: выращивание посев­ного материала в лаборатории и в посевном аппарате, промышленное культивирование в ферментере, концентрирование культуралыюй жидкости, сушка, стандартизация и фасовка готового препарата.

В условиях предприятия производственный Вас. thuringiensis var. galleriae предварительно пересевают на мясопептонный агар и про­веряют его на отсутствие свободного фага, продуктивность и вирулент­ность. Посевной материал получают стадийно: сначала выращивают культуру в конических колбах на 3 л. Полученным материалом, имею­щим титр не менее 1,7 • 10⁹ спор в 1 мл, в количестве 0,05 % от объема среды засевают посевной аппарат и проводят культивирование при объемной аэрации 0,2 л воздуха на 1 л среды в 1 мин. Посевной материал с тем же титром спор в количестве 0,0012 % от объема среды основного аппарата передают в ферментер. Температуру куль­тивирования на всех стадиях выращивания поддерживают постоян­ной (28 — 30 °С). Продолжительность ферментации в посевном аппа­рате и производственном ферментере составляет 35 — 40 ч. Осталь­ные ее параметры остаются теми же, что и при непроизводственном получении этих бактерий.

Процесс культивирования заканчивают при степени споруляции культуры 90 — 95 % и титре спор не менее 10⁹ в 1 мл. Готовую культуральную жидкость перекачивают в отдельный простерилизо-ванный сборник, подкисляют до рН 6,0 — 6,2 и подвергают сепара­ции, в результате которой получают пасту влажностью 85 % с выхо­дом около 100 кг в 1 м^ жидкости и титром порядка 20 • 10⁹ спор в 1 г. Ее сосредоточивают в отдельной емкости, а фугат при необходи­мости можно еще один или два раза употребить для приготовления питательной среды.

Подготовленную таким образом и отвечающую всем требованиям пасту направляют на получение готового препарата энтобактерина. Конечным продуктом производства может быть либо смачивающий порошок, либо стабилизированная паста. Первый получают путем пред­варительного увлажнения пасты с последующим высушиванием на распылительной сушилке до остаточной влажности 10 % и смешени-

ем (стандартизацией) с каолином до титра 30 ■ 10⁹ спор в 1 г (гото­вый препарат фасуют по 20 кг в 4-слойные крафт-мешки с полиэти­леновым вкладышем и маркируют). Стабилизированную пасту выра­батывают путем внесения в нее карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), которая сорбирует белковые кристаллы и споры, заряжая их отрица­тельно, что способствует более равномерному распределению актив­ного начала по всему объему пасты и позволяет консервантам с одина­ковой плотностью распределиться между частицами. Последнее зна­чительно увеличивает срок хранения препарата. Готовый продукт в этом варианте представляет собой вязкую жидкость кремового или светло-серого цвета, однородную по составу, не распыляющуюся и не замерзающую при хранении, без запаха, не подвергающуюся гниению или брожению.

Препарат предназначен для борьбы с насекомыми-вредителями садовых, огородных и парковых растений. Эффективен в борьбе с более чем 60 их видами. Применяют его в виде водной эмульсии пу­тем опрыскивания растений в период активного питания вредителя. Если эта процедура производится в неблагоприятных погодных усло­виях (дождь, низкая температура, повышенная солнечная радиация), то концентрацию препарата удваивают. Чем выше температура в мо­мент применения и в последующие двое суток, тем выше эффектив­ность энтобактерииа и тем скорее наступает гибель насекомых. Как правило, основная масса вредителей погибает в течение 2—10 дней. На опрыскивание 1 га овощных культур расходуют 1 — 3 кг препа­рата, садовых — 3 — 5 кг, прибавка урожая от применения энтобакте-рина соответственно достигает 50 и 5 ц с 1 га.

В биотехнологическом центре Моисаито проводятся генно-инже­нерные работы по выяснению возможности расширения спектра насе­комых, поражаемых токсином Вас. thuringiensis, а также его введения непосредственно в растения. Был получен трансгенный табак, способ­ный синтезировать токсин этой бактерии в форме химерного белка. Конструкция содержала токсикогенную часть исходного гена, начиная с кодоиа 29 по 607-й, состыкованную по С-концу с геном каиамицин-устойчивости. Такой белок обладал и полной токсикогенностыо, и спо­собностью придавать бактериальным растительным клеткам устойчи­вость к каиамицину, что успешно использовалось в процессе селек­ции нужных клонов. При этом транскрипция мРНК химерного ток­сина в 5 — 10 раз превышала экспрессию исходного токсииового гена в трансформированных клетках растений.