Практическое применение моноклональных антител

.Гибридомная технология получила в настоящее время широкое применение. Моноклональные антитела (МАВ) определяют как хими­ческий реагент известной структуры, который можно получить по жела­нию. Их очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с нужным антигеном. Сфера применения МАВ следующая:

1) количественное определение различных веществ;

2) диагностика (идентификация определенного гормона, вирусных,
бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антиге­
нов);

3) терапия.

Их можно также использовать в целях пометы и точной идентифи­кации специализированных клеток, таких, как нейроны, чтобы глубже изучить способы их взаимодействия и функционирование. Очень цен­ны моноклональные антитела и для изучения клеточных мембран. Они могут выступать и в качестве стандартного реагента для обнару­жения определенных молекул на клеточной мембране, а также для разделения популяций клеток, несущих на поверхности разные анти­гены.

МАВ способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, от­ветственных за отторжение трансплантата и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеян­ный склероз, ревматические болезни). В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-мишени. Удалось встроить МАВ в поверхность липосом. Эти липидные пузырьки, способные пересекать клеточную мембрану и переносить миллионы молекул лекарственного препарата, могут оставлять свое содержимое в клетках, против которых специ­фичны встроенные МАВ. Таким образом, лекарства, противоопухоле­вые препараты или гормоны могут попадать внутрь клеток, чтобы выле­чить их или разрушить.

Иммуноферментный анализ. На основе МАВ был разработан им-муноферментный анализ (ИФА), широко используемый в научных исследованиях и в практике (медицина, сельское хозяйство). Суть его проведения сводится к следующим стадиям:

1) формирование специфического комплекса антиген — антитело;

2) введение в этот комплекс специфической метки;

3) обнаружение комплекса тем или иным способом.

В качестве метки наиболее часто используются ферменты (перок-сидаза, щелочная фосфатаза, сукцинатдегидрогеназа, р-галактозида-за), продукты реакций которых либо сами окрашены, либо взаи­модействуют с хромогенными веществами, меняя их окраску.

ИФА предполагает, что специфический антиген (АГ1) иммобили­зуют на твердом носителе, после чего комплекс обрабатывают антите­лом (AT), а затем антигеном (АГ2) к этому антителу. При этом ко второму антигену ковалентно пришивают фермент-маркер. Затем этот тройной комплекс необходимо обнаружить. Добавляют субстрат для ферментативной реакции и хромогенное вещество (в случае если про­дукты реакции не окрашены). По появлению пятен судят о наличии тех или иных моноклональных антител в исследуемой жидкости.

Практическое применение ИФА. В медицине техника ИФА при­меняется для диагностики инфекционных заболеваний, возбудителя­ми которых являются вирусы, простейшие, бактерии, а также для диаг­ностики неинфекционных заболеваний (диабета, рака, сердечно-сосу­дистых). Используется она и при определении уровня гормонов в организме, а также позволяет контролировать дозировку лекарствен­ных препаратов, выявлять отравления, наличие наркотиков и допин­гов в организме.

Для диагностики инфекционных заболеваний применяют следую­щую методику ИФА:

1) связывают исследуемый антиген с нерастворимым носителем;

2) выдерживают иммуносорбент в сыворотке крови пациента;

3) инкубируют полученный комплекс с конъюгатом фермента с
античеловеческим антителом какого-либо животного.

При наличии антитела против исследуемого антигена конъюгат связывается с иммуносорбентом и выявляется в реакции с субстрата­ми. Эта методика используется для диагностики бруцеллеза, сифили­са, токсоплазмоза, малярии.

В настоящее время существуют тесты для определения следую­щих гормонов: инсулина, хориогонадотропина, кортизона, прогестеро­на. Они позволяют своевременно обнаруживать эндокринные забо­левания, а также выявлять беременность на ранних стадиях. Напри­мер, разработан метод определения тиреотропного гормона человека, который регулирует синтез и секрецию гормонов щитовидной желе­зы. Недостаток его приводит к гипотиреозу, а избыток — к ги-пертиреозу. Метод позволяет быстро выявлять больных, а также форму заболевания.

Тест на беременность

С давних пор беременность выявляли на мышах и лягушках, ко­торым вводили мочу пациентов. Гормон беременности — плацентар­ный хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), который появля-

ется в организме женщины на четвертый день после зачатия, вызывает у животных увеличение матки и морфологическое изменение яични­ков, что и обнаруживается на вскрытии. Иммуноферментный метод определения ХГЧ следующий:

1) антитела к ХГЧ первого типа сорбируют в лунке иммунологи­
ческой планшетки;

2) добавляют пробу биологической жидкости (кровь или мочу),
из которой весь гормон привяжется к антителам;

3) вводят антитела второго типа, меченные ферментом, они также
свяжутся с ХГЧ, если, конечно, он есть в пробе. В результате образует­
ся трехслойный «бутерброд»: антитело — гормон — антитело. Поэто­
му этот анализ еще называют иммуиоферментпым сэндвич-методом;

4) добавляют хромофор, происходит обычная иммуноферментная
реакция с ферментом-меткой, и лупка желтеет. Таким образом, можно
определять ХГЧ в пробе, начиная с концентрации 30 нг/л. При этом
сэндвич-метод полностью исключает влияние других гормонов.

На основе этого метода разработаны диагностикумы, определяю­щие причины бесплодия, время наступления овуляции, найден реаль­ный подход к иммунологическим методам контрацепции.

Благодаря использованию моиоклональных антител, полученных в результате иммунизации животных лекарствами, стало возможным определение дозы этих препаратов. В 1981 г. в США в продажу по­ступил набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. Разработаны наборы и для токсикологического анализа биологических жидкостей. В сыво­ротке крови при их помощи можно определить барбитураты, антидеп­рессанты и другие вещества.

В ветеринарии методы ИФА используют для выявления микроб­ных и вирусных инфекций, для оценки фертильности, контроля ка­чества пищевых продуктов и сырья животного происхождения.

Определение уровня фертильности может быть осуществлено на основании сравнения концентраций различных гормонов в организме животного. Сейчас для оценки репродуктивного цикла коров исполь­зуют концентрацию гормона прогестерона. Во время овуляции она относительно мала, а затем постепенно возрастает до максимума, из­меняясь при этом в крови и молоке коров параллельно, т. е. для анализа можно использовать пробы молока. Если животное стельное, то концентрация прогестерона сохраняется на высоком уровне. Исхо­дя из этого, судят о фертильности животного.

В ветеринарии существует еще ряд проблем, решение которых возможно при использовании техники иммуноферментного анализа:

1) загрязнение пищи анаболическими гормонами;

2) проникновение в молочные и мясные продукты антибиотиков;

3) применение наркотических средств для стимуляции спортив­
ных результатов животных;

4) загрязнение пищи и кормов микотоксинами.

Методика ИФА применяется в диагностике вирусных заболева­ний растений: вируса кольцевой пятнистости малины, вируса мозаики картофеля, вируса черной кольцевой пятнистости томатов. С его по­мощью определяют в пище и кормах растительного происхождения микотоксииы. Например, афлотоксииы — группа грибковых токси­нов, продуцируемых Asp. flavus. Они поражают семена кукурузы и зерновых культур. Для обнаружения афлотоксинов создан диагно­стику м.

На мелкозернистом материале иммобилизуют антитела против аф-лотоксина В1. Затем этот комплекс смешивают со стекловолокном, после чего добавляют экстракт, содержащий афлотоксин, меченный пероксидазой хрена, и хлорнафтол. В тех зонах мембраны, где обнаруживается афлотоксин, образуется нерастворимый пурпурный продукт. Анализ проводится за 5 мин.

Кроме того, ИФА применяется при производстве препаратов ме­дицинского назначения и животного сырья, а также для очистки до­норской крови.

Терапия опухолей. В 1982 г. были опубликованы открытия Фар-рандсу и его сотрудников (Великобритания). Им удалось получить антитела, специфически узнающие злокачественные опухоли толстой и прямой кишок. Больные получали инъекцию МАВ, меченных ра­диоактивным йодом. Затем на рентгенограмме определялись истин­ные размеры первичной опухоли и ее распространение в другие орга­ны.

Харрис и сотрудники (Оксфорд) идентифицировали и выделили Ся/-антитела, распознающие Сй/-антиген, представленный на клеточ­ных мембранах большого числа злокачественных опухолей человека и отсутствующий на клетках доброкачественных опухолей тех же ор­ганов и тканей, как и на нормальных клетках. Возможность обнару­жения молекулы Ся/-антигена послужила основой для создания мето­да точной диагностики раковых опухолей. Ее можно обнаружить, ког­да она состоит из миллиарда клеток. В идеале лечение рака заключа­ется в истреблении малигнизированных клеток без повреждения окру­жающих здоровых, поэтому весьма ценным качеством противоопухо­левого препарата является избирательность его действия. Но проти­вораковые лекарства действуют главным образом на быстро делящи­еся клетки, а это делает их неэффективными в отношении медленно развивающихся опухолей. Еще одним способом применения МАВ в терапии рака является соединение их с цитотоксическими вещества­ми.

Такой метод был предложен еще в 1958 г. Ж. Матэ (Франция). Ученый попытался вооружить противоопухолевые антитела анти-неопластическими средствами (метотрексат, хлорамбуцил), однако по­следние были недостаточно токсичны, а антитела не очищены. Более эффективными оказались яды растительного и микробного происхожде­ния: дифтерийный токсин, рицин (токсин из семян клещевины),

а-аманитии (компонент яда бледной поганки). In vitro эти токсины разрушают нормальные клетки так же, как раковые, поскольку они обладают способностью связываться с поверхностью любых клеток. Поэтому необходима селективность связывания. Рицин состоит из двух полипептидных цепей: А-цепь несет токсические детерминанты, а В-цепь содержит участок, распознающий галактозу, что и позволяет этому токсину связываться с клеточной мембраной. Без В-цепи он приобретал специфичность связывания благодаря антителам и не по­падал на нормальные клетки. Начиная с 1978 г. были созданы имму-нотоксиыы посредством пришивания А-цепи рицина к МАВ. Они рас­познавали антигены, характерные для новообразований человека. Препятствия к применению иммунотоксинов:

1) возможная их инактивация антителами больных;

2) вероятная нейтрализация опухолевыми антигенами, циркули­
рующими в крови;

3) неэффективность в случае очень обширного поражения опу­
холью.