В последние годы основные направления исследований по микробиологическому получению белковых веществ несколько изменились. Прежде всего следует отметить повышение внимания к изысканию новых видов сырья для их производства. В этой связи изучают фото-трофные микроорганизмы, которые растут в автотрофных условиях, потребляя углекислоту.
Культивирование водорослей с целью получения белковых веществ исследуется уже несколько десятилетий. В настоящее время наиболее эффективный способ использования биомассы хлореллы и других водорослей заключается в применении их в качестве биостимуляторов. Обнадеживающие данные имеются по выращиванию цианобактерии спирулины. Жители района оз. Чад издавна используют спирулину в питании.
Может оказаться перспективным применение в качестве продуцентов белковых веществ водородных бактерий, относящихся к хемо-литоавтотрофам.
Другой перспективный продуцент белка пищевого и кормового назначения — высшие базидиальные грибы. Согласно современным данным около 2 000 их видов из 30 родов считаются съедобными, из них только 20 видов выращивают в коммерческих целях, но всего 5 — 6 видов культивируют в промышленных масштабах, причем основными являются Agaricus bisporus, Lentinus edodes, а в нашей стране — Pleurotus ostreatus.
Народно-хозяйственное значение дереворазрушающих базидиаль-ных грибов определяется рядом особенностей, дающих им определенно
ное преимущество: их биомасса обладает приятным грибным запахом (в результате биосинтеза ароматических метаболитов). Кроме того, биомасса мицелия Basidiomycetes, например Pleurotus ostreatus, содержит до 26 % белка, чей аминокислотный состав не уступает и даже выше ряда растительных (сои, риса, пшеницы \ белков и близок к животному. Сумма аминокислот достигает до 24 — 25 % от сухой биомассы. Также здесь содержание нуклеиновых кислот очень низко (2 %), что делает грибы безвредными. Мицелий вешенки очень богат витаминами группы В: тиамином, рибофлавином, ниацином, пиридок-сином, биотином. Кроме того, в нем имеется ряд необходимых человеку металлов: железо, цинк, медь, кальций, магний.
В настоящее время мицелий съедобных грибов в виде сухого грибного порошка (ГП) используют во многих странах как ценную пищевую добавку к супам и соусам, а также вводят его в овощные и мясные концентраты. Так как мицелий представляет собой нити, состоящие из фрагментов различной величины, его очень удобно добавлять в сыры, консервированные овощи и хлебные изделия, а в последние годы также в колбасы и мясные полуфабрикаты. В Японии на основе вытяжки из ГП готовят специальные напитки.
В нашей стране был разработан ряд препаратов для использования в пищевой промышленности. Это пантигрин на основе мицелия Panus tigrinus ИБК-131 и даедалин, где продуцентом является Daedalea confragosa Г-115, у которого 1 кг препарата содержит столько же белка, сколько 1 кг мяса. В самые последние годы ГП Pleurotus ostreatus рекомендован в виде добавок к крупяным и овощным изделиям.
Кроме ГП все шире начинают использовать в кулинарии плодовые тела базидиальных грибов. На Востоке для этих целей популярен L, edodes (шиитаке).
В основе интенсивного культивирования грибов (например, вешенки) находится использование целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства и промышленности. Традиционным субстратом является солома различных злаковых культур, лесосечные отходы: щепки, опилки, кора, листья (хвойных или лиственных пород деревьев).
После сбора урожая грибов (первой и второй волн) остается неиспользованный блок субстрата, богатый разросшимся мицелием (белком), который используют как белковый концентрат в животноводстве.
Важный резерв пополнения ресурсов кормового и пищевого белка — производство его за счет глубинного выращивания грибного мицелия. Для такого его производства характерны высокая скорость, способность грибов усваивать различные отходы — углеводы, органические кислоты, крахмал, целлюлозу и т. д. Выращивание грибного мицелия в глубинных условиях является регулируемым и управляемым процессом получения белка и других метаболитов.
БИОТЕХНОЛОГИЯ БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ
Спиртовое брожение
Спиртовое брожение играет большую роль в жизни человека. Дрожжи традиционно используют в хлебопечении, для получения спирта и многих других продуктов. По значимости для народного хозяйства с ними могут конкурировать только молочно-кислые бактерии. Пожалуй, нет на земном шаре ни одного человека, который бы в своей повседневной жизни не пользовался «трудами» этих микроорганизмов.
На Востоке в качестве продуцента спиртового брожения при производстве рисового пива (сакэ) применяется Aspergillus oryza. Его могут вызывать также некоторые бактерии (Zymomonas mobilis, Z. anaerobica, Sarcina ventricula, Erwinia amylovora). Однако получение спирта с помощью этих микроорганизмов промышленного значения пока не имеет.
Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы, которые в зависимости от наличия полового процесса и его типа относят к трем классам грибов: Ascomycetes, Basidio-mycetes и Deuteromycetes. В строгом смысле он не имеет таксономического значения.
К классу Ascomycetes относят дрожжи, образующие при половом размножении сумки (аски) с эндогенными спорами. К нему принадлежат представители родов дрожжей, используемых в бродильных производствах, — Saccharomyces и Shizosaccharomyces.
В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах, содержащих чаще всего углеводы. Они растут на поверхности сладких плодов, в нектаре цветков, в сокотечеииях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Встречаются дрожжи и в водоемах. Содержатся они в пищеварительном тракте человека и животных. Большинство дрожжей — сапрофиты, но среди видов, находящихся во внутренних органах и на кожных покровах человека, имеются патогенные или условно патогенные формы, например, возбудитель кандидомикозов — Candida albicans. Некоторые дрожжи вызывают болезни растений.
Физиология дрожжей и биохимические основы спиртового брожения. Из соединений углерода дрожжи, как правило, лучше всего используют гексозы. Некоторые виды хорошо растут на средах с пен-тозами. Из полисахаридов чаще всего утилизируют инулин и крахмал. Известны дрожжи, растущие на средах с углеводородами и некоторыми спиртами, в том числе метанолом и этанолом, а также органическими кислотами и другими углеродными субстратами.
В качестве источника азота дрожжи используют обычно соли аммония, аминокислоты, небольшие пептиды, реже нитраты и нитриты. Некоторые виды нуждаются в одном или более витаминах (чаще в биотине и тиамине), другие способны все необходимые для роста витамины синтезировать сами.
Большинство дрожжей растет в границах рН от 3,0 до 8,0, оптимальные значения — от 3,5 до 6,5. Общий диапазон температур для их развития довольно широк: от 0 (даже -7 °С) до 48 — 50 °С. Оптимальными для большинства видов будут 28 — 30 °С, но некоторые расы дрожжей, например используемые в пивоварении, имеют более низкий температурный оптимум. Известны также облигатно-псих-рофильные дрожжи, не растущие при температуре выше 18 — 20 вС. Многие дрожжи — факультативные анаэробы. В условиях анаэробиоза они получают энергию в результате сбраживания углеводов, а в присутствии молекулярного кислорода — за счет аэробного дыхания.
Спиртовое брожение у дрожжей до образования пировиноград-ной кислоты отличается от гликолиза у высших организмов лишь последними этапами, на которых вместо молочной кислоты образуется этиловый спирт. Обусловлено это наличием у дрожжей пируватде-карбоксилазы, катализирующей превращение пиру вата в ацетальде-гид, который затем восстанавливается в этанол.
Гликолитическим путем (или путем Эмбдена—Мейергофа — Парнаса), который также называют фруктозобисфосфатным (ФБФ-путь), осуществляется разложение глюкозы, галактозы, фруктозы и манно-зы. Олигосахариды вначале гидролизуются соответствующими ферментами до гексоз.
Существовало мнение, что дрожжи используют пентозы лишь в аэробных условиях. В последнее время установлено, что некоторые из них способны к росту в анаэробных условиях на средах, содержащих ксилозу или ксилулозу; последние подвергаются брожению с образованием этанола. Это имеет важное практическое значение для производств, перерабатывающих в спирт древесину и отходы сельскохозяйственных растений.
Разложение пентоз и высших спиртов осуществляется дрожжами через пентозофосфатный и ФБФ-пути. Спирты вначале дегидрируются до соответствующих гексоз и пентоз.
Брожение предполагает строгое равновесие процессов окисления и восстановления. Поэтому НАД, восстановленный на одном из этапов брожения, должен окисляться на другом этапе. Последнее происходит одновременно с восстановлением ацетальдегида в этанол. Такой процесс Нейберг назвал первой формой брожения. Суммарная реакция его:
Глюкоза —> 2СО2 + 2 этанол
Ход брожения может заметно меняться в зависимости от конкретных условий. Если в культуру бродящих дрожжей добавить бисульфит натрия, который связывает ацетальдегид, он исключается из последующего процесса и блокируется:
Ацетальдегид + Na2S2O3-> Ацетальдегид (связанный)
В таких условиях акцептором электронов (водорода) от НАДН становится дигидроксиацетонфосфат, превращающийся в глице-рин-3-фосфат, а затем в глицерин (вторая форма брожения по Ней-бергу). Суммарная реакция соответствует уравнению
Глюкоза —» Глицерин + Ацетальдегид (связанный) + СО2
Суммарное количество синтезированной АТФ при такой форме брожения равно нулю, и, следовательно, процесс не может обеспечить рост клеток, но его используют в промышленности для получения глицерина.
Сходный вариант спиртового брожения наблюдается при выращивании дрожжей в щелочной среде. В этих условиях ацетальдегид окисляется НАД-зависимой дегидрогеназой в уксусную кислоту. Образовавшийся на этой стадии НАДН используется для восстановления эквивалентного количества ацетальдегида в этанол. Получающийся при окислении 3-фосфоглицеринового альдегида, он применяется одновременно и для восстановления дигидроксиацетонфосфата в гли-церин-3-фосфат, который затем превращается в глицерин (третья форма брожения по Нейбергу). Суммарная реакция выражается уравнением
2 глюкоза + Н2О —> 2 глицерин + Этанол + Уксусная кислота + 2СО2
Такой химизм процесса благоприятен для клеток, поскольку образующаяся уксусная кислота снижает рН среды, после чего вновь возобновляется нормальное спиртовое брожение. В начальной его стадии дигидроксиацетонфосфат также выполняет роль акцептора электронов до того момента, пока не накопится ацетальдегид, необходимый для окисления НАДН. Этим объясняется наличие в начале брожения своеобразного периода индукции, во время которого появляется глицерин. Одновременно 3-фосфоглицериновый альдегид превращается согласно реакциям ФБФ-пути в пировиноградную кислоту, последняя затем декарбоксилируется в ацетальдегид. Но последний не может восстанавливаться в спирт, так как НАДН использован для выделения глицерина из дигидроксиацетонфосфата. Поэтому при образовании в процессе брожения одной молекулы глицерина накапливается одна молекула пировиноградной кислоты или ацетальдегида, которая не превращается в этиловый спирт. Спиртовое и глицеринпи-ровиноградное брожения тесно связаны. Вначале преобладает глице-ринпировиноградный его вид, но даже в период бурного брожения наряду со спиртом обнаруживаются другие продукты.
В присутствии молекулярного кислорода дрожжи быстро переключаются с брожения на аэробное дыхание. При этом пировино-градная кислота, образующаяся из глюкозы и других субстратов, окисляется через цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) до СО2 и Н2О. Кроме того, ЦТК обеспечивает клетки рядом метаболитов, необходимых для дальнейших биосинтетических реакций. В энергетическом отношении дыхание более выгодно, чем брожение. Поэтому в аэробных
условиях дрожжи растут лучше и образуют большую биомассу. При выращивании их в аэробных условиях на средах с этанолом или ацетатом помимо ЦТК важное значение имеет функционирование у них глиоксилатного шунта.
Подавление брожения в аэробных условиях носит название эффекта Пастера. Он связан, видимо, с различием энергетического заряда клеток в аэробных и анаэробных условиях. Дыхательная система и субстратное фосфорилирование конкурируют за АДФ. Кроме того, значение имеет аллостерическая регуляция фосфофруктокиназы. Фермент ингибируется АТФ и активируется АМФ. В анаэробных условиях содержание АТФ низкое, а активность фермента высока, в аэробных — отношение АТФ: АМФ повышается и активность фосфофруктокиназы снижается. Известно также, что аллостерическим ингибитором последней является цитрат — промежуточный продукт ЦТК.
Спиртовое брожение может происходить в условиях значительной
аэрации при высоком содержании глюкозы в среде (1,5 — 2,0 %).
Подавление аэробного дыхания при высокой концентрации глюкозы
(высокой скорости ее усвоения) называется эффектом Крэбтри, или
катаболитиой репрессией. Этот эффект не наблюдается при выращи
вании дрожжей на средах, содержащих менее усваиваемые сахара.
Катаболитная репрессия аэробного дыхания не только снижает полу
чение дрожжами энергии, но и подавляет биосинтез промежуточных
продуктов ЦТК и гликосилатного цикла. В таких условиях необходи
мые для биосинтеза кислоты ЦТК образуются путем карбоксилирова-
ния пирувата: Пируват.
тл карбоксилаза
Пируват + АТФ + СО2 + Н2О------------ >Оксалоацетат + АДФ + фн
Выше уже указывалось, что в начале спиртового брожения преобладает глицеринопировиноградное брожение, приводящее к образованию глицерина и пировиноградной кислоты. Однако последняя обнаруживается, как правило, в небольших количествах, поскольку основная ее часть идет на образование различных вторичных продуктов. К ним относятся уксусная, молочная, янтарная, пропионовая, муравьиная и некоторые другие кислоты, ацетон, диацетил, ацетоин, 2,3-бутан-диол, различные альдегиды и сложные эфиры.
При сбраживании дрожжами Сахаров обычно накапливается небольшое количество £(-)-молочной кислоты. Исключением является Saccti. veronae, синтезирующий £(+)-молочную кислоту. К продуктам брожения, образующимся из пировиноградной кислоты в небольшом количестве, относятся также лимонно-яблочная и диметил-глицериновая кислоты.
Кроме вторичных продуктов при спиртовом брожении образуются побочные продукты — высшие спирты, известные под названием сивушных масел. Почти половину общего их количества составляют два изоамиловых спирта: 3-метилбутанол-(1) и 2-метилбутанол-(1).
Наряду с ними в сивушном масле содержатся изобутилеиовый, н-бу-тиловый, н-пропиловый и ароматические спирты (р-феиилэтиловый, р-оксифеиилэтиловый). Эти продукты синтезируются из соответствующих кетокислот, образующихся в результате метаболизма углеводов, или из аминокислот. Поэтому вторичные и побочные продукты невозможно строго разграничить. Они существенно влияют на вкус и аромат готового продукта; накопление их не коррелирует с образованием этанола, и сброженные растворы, содержащие одинаковое количество спирта, могут отличаться по вкусовым и ароматическим качествам.
Образование высших спиртов включает дезаминирование аминокислоты в кетокислоту, которая декарбоксилируется в альдегид; последний восстанавливается в спирт.
Однако не все высшие спирты синтезируются из аминокислот. Второй путь их образования можно рассматривать как биосинтез из продуктов метаболизма углеводов. Так, при конденсации пировино-градной кислоты с уксусным альдегидом или с ацетил-КоА образуется ацетомолочная кислота, которая превращается в 2-кетоизовалериано-вую кислоту. В результате ее декарбоксилирования получается изо-масляный альдегид, восстанавливающийся в изобутанол.
Полагают, что некоторые высшие спирты могут синтезироваться обоими путями (из аминокислот и углеводов), другие — только из продуктов метаболизма углеводов.
При спиртовом брожении образуются также серосодержащие вещества — сероводород и сульфиты. Последние могут быть в форме ионов бисульфит HSO3 или сернистой кислоты (H2SO3). Синтез этих веществ связан со способностью дрожжей восстанавливать SO*2" в S2" через сульфит (SO|~). Восстановление сульфатов в сульфиты зависит от свойств штамма дрожжей. На образование H2S влияют интенсивность брожения и присутствие ионов меди и цинка.
Из других серосодержащих веществ в незначительном количестве могут образовываться меркаптаны (этилмеркаптаны, метилмеркапта-ны) — летучие вещества с неприятным запахом. Выделение СО2 при брожении способствует удалению этих веществ из среды.
Характеристика дрожжей, применяемых в промышленности. Дрожжи, используемые для получения спирта, относятся в основном к роду Saccharomyces. Он включает семь видов, размножающихся вегетативно преимущественно в диплоидной фазе: Sacch. cerevisiae, Sacch. kluyveri, Sacch. exiguus, Sacch. dairensis, Sacch. servazzii, Sacch. tellustris, Sacch. unisporus. Как синонимы Sacch. cerevisiae рассматриваются Sacch. bayanus, Sacch. carlsbergensis и ряд других названий промышленно важных дрожжей.
Наибольшее значение имеет Sacch. cerevisiae. К этому виду относятся расы дрожжей, используемые в хлебопечении, спиртовом производстве, пивоварении, виноделии, при изготовлении кваса. Поэтому приводим характеристику вида.
Saccharomyces cerevisiae Harisen. На солодовом сусле в трехсуточной культуре при 28 °С клетки имеют сферическую, эллипсоидальную или несколько удлиненную формы, располагаются единично или парами, иногда образуют короткие цепочки или мелкие грозди. В зависимости от размера клеток штаммы этого вида можно разделить на три морфологические группы.
К первой группе относятся штаммы, имеющие самые крупные клетки ((3,5 -г- 10,5) х (5,0 + 21,0) мкм), ко второй — с наименьшими ((2,5 -s-7,0) х (11,0 + 19,0) мкм), к третьей — промежуточные ((3,5 + -5-8,0) х ((5,0 -ь 11,5) -5- 18,0) мкм). Некоторые из них образуют удлиненные клетки, достигающие 30 мкм и более.
Колонии у этих дрожжей пастообразные, кремовые или коричневато-кремовые, обычно с довольно ровной, гладкой, иногда слегка пузырчатой или покрытой точками поверхностью с блестящими или тусклыми секторами. Край колоний цельный, иногда лопастный, изредка образуется примитивный псевдомицелий.
Аски обычно содержат от одной до четырех спор шаровидной или эллипсоидальной формы. Их образование легко вызвать при высеве дрожжей на агар с ацетатом.
Получение этилового спирта. В эпоху промышленного прогресса спирт широко применяют как растворитель и химическое сырье для производства синтетического каучука. В настоящее время в нашей стране большая часть этилового спирта используется на технические нужды, остальная — в медицине и для других целей.
В процессе спиртового брожения, как отмечалось выше, наряду с основным продуктом брожения — этанолом — образуются побочные продукты: глицерин, высшие спирты, сивушные масла, альдегиды, органические кислоты, эфиры, углекислый газ. Большинство из них находит практическое применение. Сивушное масло и эфироальдегидную фракцию выделяют при ректификации этилового спирта и выпускают в виде технических продуктов. Углекислый газ улавливают, очищают от сопутствующих примесей и превращают в жидкую углекислоту. Ее используют в разных целях, в том числе для газирования воды, пива и безалкогольных напитков; она эффективна при сварочных работах как защитный агент против окисления швов, а также в литейном и других производствах. Сухой лед, получаемый из сжиженного углекислого газа, применяют в качестве хладоагента в пищевой промышленности, медицине, машиностроении и энергетике. Выделенную после брожения биомассу дрожжей употребляют в хлебопечении, а на барде после отгонки спирта выращивают кормовые дрожжи.
Сырьем для производства спирта служат разнообразные растительные материалы, содержащие в достаточном количестве сбраживаемые сахара или другие углеводы, которые можно осахарить. Наиболее широко используются крахмалосодержащие зерно (рожь, пшеница, кукуруза, ячмень, овес, просо) и картофель, сахаросо держащие меласса (отход сахарного и крахмало-паточного производства), дефект-
пая сахарная свекла, а также древесина и отходы сельскохозяйственных растений. Дальнейший рост производства спирта будет идти в основном по пути увеличения мощностей предприятий, применяющих непищевое сырье.
Процесс производства спирта из крахмалистого сырья включает ряд стадий (рис. 12). Вначале его измельчают и разваривают с целью извлечения и растворения крахмала. Поскольку последний не подвержен действию ферментов дрожжей, способных сбраживать только дисахариды и моносахариды, охлажденную разваренную массу обрабатывают амилолитическими ферментами солода (пророщенного зерна) или грибов (A. oryzae, A. niger и др.). Осахаренная масса (затор) содержит смесь углеводов, состоящую из мальтозы, глюкозы и декстринов. Кроме того, в ней имеются пептиды, аминокислоты, фос-форорганические соединения, минеральные соли и микроэлементы.
Следующая стадия — сбраживание осахаренной массы. На отечественных спиртовых заводах применяют периодический и непрерывно-поточный способы брожения. Для этого используют естественно-чистые культуры дрожжей. Для подавления в них размножения бактерий пастеризованный и охлажденный до 30 °С затор подкисляют серной кислотой до значений рН, равных 3,8 — 4,0. Они, конечно, менее благоприятны для развития дрожжей, чем рН 4,5 — 5,0, но медленное их размножение компенсируется возможностью получения практически чистой культуры в нестерильных условиях.
Спиртовые дрожжи, применяемые при переработке крахмалистого сырья, должны обладать высокой бродильной активностью, быстро и полностью сбраживать сахара, а также использовать другие компоненты питательной среды в анаэробных условиях, быть устойчивыми к продуктам своего обмена (особенно к спирту), хорошо противостоять развитию инфекции. Уже около 70 лет применяют Sacch. cerevisiae, раса XII. Эти дрожжи отлично сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, на */з ~~ раффинозу, несколько слабее галактозу. В среде накапливают до 10 — 11 % спирта. Раса XII — верхнебродя-щая, хорошо распределяющаяся во всем объеме затора, пылевидная, не образует хлопьев. Оптимальная температура ее развития от 30 до 38 °С, максимальная — 38 °С, минимальная — 5 °С. Значение рН во время брожения поддерживают в пределах 3,8 — 4,0. Используют также другие расы дрожжей, но не так широко. После сбраживания заторов остаются неиспользованными около 0,1 % галактозы, 0,4 % декстринов и 0,5 % пентоз.
Проводится селекционная работа по получению рас дрожжей с более высокими производственно ценными свойствами, в частности,способных интенсивно использовать галактозу и декстрины. В последние годы большое внимание уделяется селекции термотолерантных рас, дающих в промышленном производстве ряд преимуществ (ускорение микробиологических процессов, уменьшение расхода хладо-агента и др.).
.148
Зерно
Картофель
Солодовое зерно
| Очистка ■--------- г--------------- | Мойка | |||
| Взвешивание | 1_________ z__________. 1 Взвешивание | |||
| Измельчение | Измельчение | |||
| Приготовление замеса (кашки) | ||||
Замачивание
Солодоращение
токовое, ящичное
или пневматическое
Транспортирование солода
Предварительный нагрев сырья
| Перекачивание замеса (кашки) | |||||
| / | |||||
| Периодическое разваривание | Непрерывное разваривание | ||||
Дезинфекция
Дробление
Приготовление солодового молока
Паросепарирование разваренной массы
Охлаждение разваренной массы до температуры осахаривания
Осахаривание разваренной массы
Препараты плесневых