Получение микробных полисахаридов в промышленности

Открытие новых микробных полисахаридов, имеющих практиче­ское значение, обусловило успехи в области организации их производ­ства. В настоящее время микробиологическая промышленность мно­гих стран выпускает ряд ценных экзогликаиов: декстраи (Россия и другие страны), ксантан (США, Франция), пуллулан, курдлаи (Япо­ния), склероглюкаи, или политран, занфло (США). Решаются вопро­сы внедрения в производство ряда других полисахаридов, детально изученных в лабораторных условиях, проверенных на практике и производимых в полупромышленном масштабе.

Получение различных полисахаридов не универсально. Для каж­дого гликана оно имеет свои особенности, определяемые физиологией продуцента, локализацией и физико-химическими свойствами полиме­ра, областью его применения.

Производство экзополисахаридов имеет преимущества перед по­лучением внутриклеточных, так как экзогликаны образуются, как пра­вило, в значительно большем количестве, легче отделяются от биомас­сы и очищаются от примесей. Однако в этом процессе имеются и неко­торые технологические трудности. Накопление полисахарида в среде приводит к ограничению доступа кислорода к клеткам. У аэробных микроорганизмов это снижает энергетический баланс и тормозит син­тез гликана. Повышенная вязкость среды делает невозможным отде­ление последнего от клеток продуцента из нативной культуральной жидкости. Ее приходится разбавлять в несколько десятков раз, а пос­ле удаления клеток концентрировать до первоначального или мень­шего объема. Решение этих проблем связано с дополнительными за­тратами.

Приведем основные этапы производства наиболее широко приме­няемого сейчас полисахарида — декстрана (рис. 10).

Приготовление посевного материала культуры Leuconostoc mesenteroides в лаборатории

Выращивание посевного материала культуры Leuconostoc mesenteroides в ииокуляторс

Процесс биосинтеза декстрана культурой Leuconostoc mesenteroides в ферментаторе

Химическая очистка декстрана из культуральной жидкости

Первое и второе персосаждение нативного декстрана

Отгонка спирта из раствора под вакуумом

I

Кислотный гидролиз нативного декстрана

Фракционирование частично гидролизованного декстрана

Первое и второе

осаждение и отделение

высокомолекулярной

фракции декстрана

Осаждение

среднемолекулярной

фракции декстрана

Первое и второе

переосаждение

среднемолекулярной

фракции декстрана

Рис. 10. Схема производства декстрана с целью получения кровезаменителей

Плазмозамеиители из декстранов выпускают под различными на­званиями: клинический декстран, полиглюкин, синкол, макродекс, плаз-модекс, хемодекс и др. Для получения декстранов используют штам­мы Leuconostoc mesenteroides. Ферментацию ведут на среде с 10 — 30 % сахарозы, декстраном-затравкой, дрожжевым экстрактом, мине­ральными солями. Создают условия, способствующие синтезу той формьч декстраиа_г которая используется в качестве плазмозаменителя: линейного глюкана, имеющего более 90 % а-1,б-связей, с молекуляр­ной мааюй 60 — 80 к Да. Для этого ограничивают содержание в среде магния, Стимулирующего синтез разветвленных декстранов, вносят затравку \в виде декстрана, имеющего молекулярную массу 20 — 30 кДа. Т\акой акцептор обеспечивает преимущественное образова­ние необходимого полимера.

Наивысшей биологической активностью отмечаются декстраны, содержащие менее 70 % а-1,б-гликозидных связей, т. е. более развет­вленные. Их синтезу способствует кроме магния замена сахарозы мелассой. Оптимальное значение рН для роста продуцента находит­ся в пределах 6,5 — 8,0, а для накопления декстрансахаразы — около 7,0. Для среды оно обычно задается в интервале 7,0 — 8,0.

Бактерий расщепляют сахарозу на глюкозу и фруктозу. Послед­няя сбраживается по типу гетероферментативного молочно-кислого брожения с образованием молочной и уксусной кислот, маннита и СО₂. Глюкоза(полимеризуется в декстран. Процесс идет быстро, и продукт можно¹ получить уже через 24 ч.

Декстран вщделяют из культуральной жидкости, например, мета­нолом. Можно,;используя определенные приемы, осаждать фракции клинического дфкстрана с молекулярной массой 60 — 80 кДа даже из смеси этих полисахаридов разной молекулярной массы. Возможно осадить весь прбдукт, растворить его в воде и изолировать требуемый декстран фракционированием. При необходимости его деполимери-зуют (ферментативно, термической обработкой или ультразвуком), а для очистки неоднократно растворяют в воде, переосаждают метано­лом и фракционируют.

Поскольку декстрансахараза в значительной степени выделяется в среду и синтез полимера идет вне клетки, декстраны получают и ферментативным путем. Для этого продуцент выращивается в усло­виях, обеспечивающих наиболее высокую активность внеклеточного ферментного комплекса. В период максимальной активности дек­странсахаразы культуральную жидкость отделяют от клеток и кон­сервируют, снижая значение рН до 5,0 — 5,2. При такой кислотности и температуре около 15 °С декстрансахараза, содержащаяся в культу­ральной жидкости, сохраняет активность не менее месяца. В нашей стране разработана технология получения частично очищенной дек­странсахаразы. Ферментационная среда должна содержать сахарозу и декстран-затравку. Процесс синтеза продолжается около 8 ч. Фер­ментативный способ удобнее микробиологического, так как он

поддается более надежному контролю и регулированию, позволяет од­ним только варьированием исходных концентраций сахарозы и фер­мента, а также температуры процесса сразу получать декстраи необ­ходимой молекулярной массы. Это значительно упрощает и удешевляв ет последующие технологические операции. Широкое применение в промышленности может найти использование иммобилизоваипых/дек-страисахараз.

В нашей стране в 1983 г. выпущена первая промышленная серия конъюгатов модифицированного декстраиа со стрептокиназой + стреп-тодеказа — пролонгированная с помощью декстрана форма/стрепто-кииазы.

Ксаитаи, продуцируемый Xanthomonas campestris, выпускают под названиями: биополимер Хс, келцан, ксантаи, келтрол. Бактерии куль­тивируют на среде, содержащей 1 — 5 % углеводов (кукурузный крах­мал, сахар-сырец, меласса и др.), органическое соединение азота, дву-замещепиый фосфорио-кислый калий и микроэлементы, рН среды со­ставляет 6,5 — 7,2. Инкубацию проводят в аэробных уровнях при 28 ^вС и в течение 72 ч. Для улучшения свойств полисахарида к среде во время ферментации добавляют формальдегид. Это позволяет по­лучать гликан с повышенной устойчивостью к различным неблаго­приятным факторам, в том числе к температуре и засолению. Поли­мер используют в виде раствора вязкой культуралыюй жидкости или в виде порошка, высушенного в струе горячего воздуха. В последнем случае полисахарид отделяют от клеток центрифугированием и очи­щают осаждением этанолом, метанолом или ацетоном в присутствии электролита.

Интенсивные поиски микроорганизмов, синтезирующих полиса­хариды типа ксаитана, ведутся в различных странах.(Активные про­дуценты среди бактерий рода Xanthomonas найдены в нашей стране. Разрабатывается технология получения отечественного ксаптаиа в промышленном масштабе.

Нередко иативные полисахариды не обладают желаемыми каче­ствами. Они могут быть, например, недостаточно активны или, будучи высокоэффективными, плохо растворимы или токсичны, что препят­ствует их применению, и т. д. Чтобы улучшить их действие, устранить или снизить нежелательные явления, т. е. получить препарат с нуж­ными свойствами, выделенные полисахариды иногда подвергают хими­ческой модификации. Так, декстран сульфатируют, чтобы придать ему аитикоагулирующую активность. Обработка нативного гликана A. faecalis var. myxogenes солюбилизирующими агентами позволяет получить производные, образующие гели без предварительного нагре­вания. Растворимость глюкана A. pullulans и маннана R. ruhra удает­ся повысить карбоксиметилированием. Снижение токсичности проти­воопухолевого препарата белково-липополисахаридного комплекса из культуральной жидкости Serratia piscatorum достигается обработкой его щелочью. Получение производных полисахаридов связано с до­полнительными технологическими операциями.

Все более широкое применение для производства экзогликаиов находит метод непрерывного культивирования продуцентов. С его помощью в ряде стран уже производят многие перспективные в прак­тическом отношении полисахариды (ксаитаи, курдлан и др.). Этот способ весьма эффективен и экономичен, поскольку позволяет дли­тельно получать продукт в период его максимального накопления и наиболее полно использовать субстрат. Подсчитано, что процент кон­версии углеродного субстрата в экзополисахариды при проточном куль­тивировании в 2 — 3 раза выше, чем при периодическом. Обычно в качестве лимитирующего фактора в хемостате используют азот, а так­же фосфор и серу. Это обеспечивает интенсивное накопление экзо­гликаиов. Благодаря правильному подбору условий ксаитаи получа­ют при непрерывном культивировании продуцента в течение многих сотен часов.

В настоящее время разрабатывается производство ряда других практически ценных полисахаридов. Так, на опытной установке Крас­ноярского завода медпрепаратов получают аубазидан и суспензии сульфата бария на аубазидане. Создается опытио-промышлепная уста­новка для наработки маниаиа, продолжаются эксперименты по полу­чению проДигиозаиа и группоспецифических полисахаридов менин­гококков (вакцин).

Перед микробиологическим производством полисахаридов стоит ряд задач. Одна из важнейших — замена дорогостоящих Сахаров (традиционного источника углерода для получения многих полиса­харидов) более дешевым сырьем. В связи с этим ведутся поиски мик­роорганизмов, растущих и образующих полисахариды при использо­вании углеводородов, этанола, метанола. Спирты как источники угле­рода, несомненно, удобнее углеводородов, так как они хорошо раство­римы в воде, что значительно упрощает технологию выделения и очи­стки продукта. Использование для культивирования микроорганиз­мов более простых по составу сред — синтетических или диализоваи-иых — необходимо при получении высокоочищеииых антигенов. Деше­вый субстрат — гидролизат торфа — предлагается использовать для производства пуллулана.

Необходимы поиск новых продуцентов полисахаридов с полез­ными свойствами, особенно внеклеточных, и селекционно-генетические исследования перспективных микроорганизмов с целью получения вариантов с повышенной продуктивностью гликапов. Метод экспери­ментальной селекции активных штаммов нередко оказывается более быстрым и экономичным в сравнении с поиском таковых в природ­ных условиях. Так, в результате действия низкой температуры с по­следующим облучением быстрыми нейтронами удалось отобрать вари­анты X. campestris, обладающие повышенным синтезом ксаптаиа.

Поскольку микроорганизмы являются поистине неиссякаемыми источниками полисахаридов, можно не сомневаться, что среди этих полимеров будут обнаруживаться вещества, оригинальные в химиче­ском отношении и представляющие большую ценность для практики.