Важное место в биотехнологических производствах занимает масштабирование ферментации, т. е. культивирование микроорганизмов в промышленных условиях (ранее говорилось о лабораторных исследованиях). Известно, что процесс, идущий в лабораторных условиях, в масштабах крупного производства может протекать неэффективно (если вообще существует такая возможность). В лаборатории для биотехиолога важен высокий выход продукта на массу биомассы в единицах на 1 мл культуральной жидкости или за единицу времени, при переходе же к промышленным условиям приоритетной становится задача максимального выхода продукта при минимальных энергетических (и других) затратах и времени. Значительная часть исследований в биотехнологии посвящена масштабированию при аэробных фермеитациях, поскольку именно с этими процессами связаны сложные проблемы, касающиеся перемешивания и массопереиоса.
Культивирование микроорганизмов в промышленных условиях — сложный процесс, зависящий от:
1) числа генераций микроорганизма;
2) способов культивирования;
3) стерилизации среды и воздуха;
4) перемешивания и аэрации;
5) переноса тепла;
6) стабилизации культуры. Рассмотрим подробнее все эти фак
торы.
Число генераций. Число генераций — это время, необходимое для достижения нужной конечной концентрации биомассы в объеме ферментера. Если предположить, что культура находится постоянно в экспоненциальной фазе роста, то
или
Yjl. = ei* (18)
где V — объем ферментера; х — концентрация биомассы; X — общая биомасса (Vx); \i — специфическая скорость роста; е — основание натурального логарифма; t — время. Учитывая известные взаимо-
отношения между jii, временем удвоения (td) и числом генераций (Nr), предыдущее уравнение можно записать как
или
Nr= l,44(ln V + In х - In Xo). (20)
Представленное уравнение показывает прямое отношение между числом генераций и логарифмом объема ферментера (верно для принятых условий о равном размере инокулюма Хо), говорит об идентичности ростовой среды, которая в свою очередь поддерживает одну и ту же конечную концентрацию биомассы — X. Если популяция клеток неоднородна, но вариант имеет ту же скорость роста, что и родительский штамм, фракция вариантов через NT генераций будет
X &т + Хп U - е
Хщ + Хп
где Хт — биомасса варианта; Хп — биомасса родительского штамма; Хп и Хт — биомасса в момент инокулироваиия. В более общем случае0, когд& родительский штамм и вариант имеют различные скорости роста, уравнение примет вид
Хп
17' (22)
где а — отношение специфической скорости роста варианта к скорости роста родительского штамма; X — скорость появления вариантов, выраженная как число вариантов, образованных на геном / генерацию. На практике может возникать несколько вариантов. Из уравнений (21), (22) следует, что с увеличением масштабов ферментации частота возникновения нежелательных вариантов возрастает.
Стерилизация. В биотехнологических производствах стерилизуют среды, входящий и выходящий воздух, а также оборудование биореактора для предотвращения заражения культуры во время ферментации. Для сред чаще всего используют тепловую стерилизацию, полнота которой зависит от вида микроорганизма, состава среды, значения рН и размера суспендированных частиц. В лаборатории она легко достигается при автоклавировании в течение короткого периода времени. В производственных масштабах большие объемы сред (от 10 до 50 тыс. л) требуют большего времени для этой процедуры, что приводит к ухудшению их свойств. В настоящее время применяют непрерывную тепловую стерилизацию, где среда нагревается до 150 °С за несколько минут. С увеличением размеров емкости ферментера площадь его поверхности резко уменьшается относительно
объема, что затрудняет передачу тепла. В воздухе содержится 5 — 2 000 микроорганизмов на 1 м3, из них 50 % — споры грибов, 40 % — грамотрицательные бактерии. Ферментеры обычно работают со скоростью аэрации, т. е. 0,5 — 1,0 объемов воздуха / (объем жидкости • мин). В современных условиях при стерилизации используют систему мембранных фильтров или фильтров из стекловолокна (раньше они были из стеклянных волокон, которые плохо выдерживали тепловую стерилизацию). Мембранные фильтры изготавливают из эфиров целлюлозы, полисульфоиа, нейлона. Их можно легко заменить в случае необходимости. Фильтров, предотвращающих заражение бактериофагом, пока нет.
Перемешивание и аэрация. Для максимального выхода продуктов важными факторами являются: оптимальная температура культивирования, концентрация растворенного О2, одинаковый уровень рН в разных частях реактора, которые зависят от хорошего перемешивания. Аэрация выполняет две функции: обеспечение кислородом и удаление СО2 и других летучих метаболитов из культуралыюй жидкости. Сохранение постоянства KLa служит одним из главных принципов масштабирования.
Перенос тепла. Культивирование микроорганизмов осуществляется при определенной температуре, и это требует поддержания теплового баланса в ферментере, который в общем виде выглядит так:
У перемет «испар «теплообмен ~~ ^'
Чтобы удовлетворить этим условиям, необходимо удалить тепло из системы со скоростью теплообмена (Отеплообмсн^- -^го0ТВ°Д обычно осуществляют с.помощью специальных охладителей, содержащих воду. Поверхность обмена, доступная для удаления тепла из единицы объема жидкости, снижается при увеличении размеров масштабирования, что и определяет размеры биореактора. Это достигается тогда, когда скорость образования тепла равна максимальной скорости его удаления:
Отеплообмен =
где U — коэффициент общего переноса тепла, ккал / (м2 • ч); Aq — площадь теплообмена / объем жидкости, м2; АГ]т — логарифм значения разницы температур между культуралыюй и охлаждающей жидкостями. Масштабы ферментации отражаются в уравнении различными способами, но главное влияние осуществляется через Aq, так как Ас ~ 1/Dj, где D± — диаметр мешалки. &Т\т обычно не зависит от масштабирования, если используют один и тот же охладитель, но на Отеплообмен влияет скорость аэрации. Снижается величина U, так как приходится увеличивать толщину стенок для больших ферментеров. В целом при масштабировании перенос тепла уменьшается, что может влиять на размеры ферментера.
Стабильность культуры. При культивировании микроорганизмов возникает ряд проблем. Так, например, известны механизмы генетической нестабильности: возникают диссоциация гетерокарионов, митотическое несоответствие у грибов, но общих методов контроля этих явлений нет. Возможный подход может состоять в том, чтобы отыскать вещества, селективно иигибирующие непродуктивные штаммы, но это в настоящее время проблематично. В случае генно-инженерных штаммов, несущих плазмиды, существует сходная ситуация. Нестабильность может вызывать большую склонность плазмид к мутациям или их исчезновение.
Большие трудности возникают при масштабировании процессов с нитчатыми организмами, которые часто создают высокую вязкость и «неныотоновскую» ферментацию. Это приводит к образованию иегомогеиности культуры, высокорежущих зон и низкой вязкости вокруг лопастей мешалок, слаборежущих зон и высокой вязкости в отдалении от них, и все это отражается на массопереносе. Другая проблема, связанная с вязкостью, — это удаление тепла (пропорционально градиенту температуры между культурой и теплообменником).
К параметрам, которые используют в качестве критериев при масштабировании, относят: постоянство потребления энергии на единицу питательной среды; сохранение (по сравнению с лабораторными условиями) той же объемной скорости переноса кислорода. Дополнительным критерием может служить скорость мешалки, которая находится в области 5 — 7 м/с для многих продукционных ферментеров. От их объема зависит время перемешивания. В сохранении одного и того же геометрического типа ферментера на пилотной установке и на заводе необходимости нет, если выполняются другие вышеуказанные условия. При масштабировании должно поддерживаться постоянство потребления энергии (на ед. объема). Для обеспечения указанного требования необходимо учитывать зависимость между потреблением энергии (Pg) и параметрами ферментера. Предложенная В. Крюгером, она выглядит следующим образом:
Pg = K(P?NDf /Q0'56)0'45, (25)
где Pg — требуемая энергия для аэробного биореактора; К — константа (функция геометрии ферментера); Р^ — энергия, потребляемая неаэрируемым ферментером; N — частота вращения мешалки, об/мин; Di — диаметр мешалки, см; О — скорость аэрации, м3/(м3 • мин), т. е. объем воздуха на объем жидкости в минуту. Было установлено, что указанная выше зависимость верна для разных ферментеров от 20 л до 30 тыс. л.
В настоящее время происходит внедрение генно-инженерных штаммов, а их практическая ценность выявляется после культивирования в промышленных условиях.
Очень часто плазмидные штаммы растут медленно, при этом снижение скорости роста пропорционально величине плазмид. Кроме того, данное обстоятельство часто возникает по причине выработки клонированными генами продуктов высокого качества. Поэтому в промышленности, где клетки проходят большое число генераций, возможно полное вытеснение плазмидных клеток дикими штаммами (сегрегационная нестабильность) или части плазмид (структурная нестабильность).
Глава 5