Производство лимонной кислоты




В производстве лимонной кислоты применяются три способа фер­ментации: 1) культивирование продуцента на поверхности твердой питательной среды (твердофазная ферментация); 2) поверхностное культивирование па жидкой среде; 3) погруженное глубинное куль­тивирование.

Культивирование на поверхности твердой среды. Гриб-проду­цент (Л, niger) выращивают в неглубоких лотках на поверхности влажных отрубей риса или пшеницы. Во время ферментации рН этой массы падает до 1,8 — 2,0. После окончания процесса лимонная кис­лота вместе с небольшим количеством одновременно образовавшихся глюкоиовой и щавелевой кислот экстрагируется водой, а затем осаж­дается в виде соли кальция. В связи с тем что отруби богаты железом и другими микроэлементами, используют штаммы A. niger, не чувстви­тельные к высоким концентрациям металлов. Такой наиболее простой метод получения лимонной кислоты применяется только в Японии.

Поверхностное культивирование на жидкой среде. Этот метод широко используется для производства лимонной кислоты в странах Европы и Америки. Поверхность жидкой среды, разлитой в неглубо­кие кюветы, засевают конидиями гриба-продуцента. Емкости разме­щают па стеллажах в термостатированных бродильных камерах. Гриб развивается в виде плотной пленки на поверхности питательной сре­ды, содержащей высокие концентрации сахара. Образующаяся ли-


монная кислота переходит из клеток мицелия в раствор, из которого после окончания процесса ее осаждают в виде кальциевой соли, а затем переводят в форму свободной кислоты и кристаллизуют.

Получение посевного материала (спор гриба) проводят в споро­вых цехах, имеющихся только на некоторых заводах, они обеспечива­ют своим продуктом все предприятия. Приготовление питательной среды и превращение сахара грибом в лимонную кислоту, а также последующее отделение мицелия осуществляются в бродильном цехе. Выделение лимонной кислоты из сброженных растворов и получение ее в кристаллическом виде происходят в химическом цехе.

В качестве продуцентов лимонной кислоты при поверхностном методе ее получения па большинстве заводов нашей страны, а также в ряде фирм за рубежом используются мутаитиые штаммы А. пгдег (например, Р-1 и Р-3).

Производство посевного материала осуществляют в стерильных условиях следующим образом. Споры исходной коллекционной куль­туры высевают на поверхность агаризованной питательной среды, раз­литой в алюминиевые кюветы площадью 10—12 дм2, последние поме­щают в термостат. На поверхности среды формируется плотная плен­ка мицелия, которая затем покрывается конидиями. Через 10 сут пленки просматривают и отбраковывают те из них, в которых обнаружено незрелое спороношение или инфекция. С поверхности мицелия споры собирают с помощью устройства, работающего по принципу пылесоса, затем их просушивают в термокамере при 28 — 30 °С, смешивают со стерильным активированным углем в отношении 1:2, расфасовывают в стерильные колбы и банки емкостью 0,5 — 1,0 л, закрывают ватны­ми пробками и сохраняют при комнатной температуре. Срок годности спор — б мес. В таком виде посевной материал передается на заводы, производящие кислоту.

Выращивание гриба осуществляют в плоских кюветах (высота бортов — до 20 см), расположенных одна над другой на стеллажах в бродильной камере, их может быть два и более в зависимости от размера последней. На каждом стеллаже размещается 8—10 кювет, расстояние между которыми (по вертикали) составляет 30 — 40 см. Изготавливаются они из нержавеющей стали или чистого алюми­ния — материалов, не подвергающихся коррозии и не загрязняющих среду ионами Fe. Заполнение кювет стерильной средой и слив из них сброженного раствора производятся через штуцер в дне этой емкости, соединенный шлангом с общим стояком, находящимся вне камеры. Последняя оборудована системой приточно-вытяжной вентиляции, обеспечивающей подачу стерильного воздуха необходимой температу­ры и влажности, который равномерно распределяется по всей камере.

Среду готовят в специальном отделении. В качестве источника углерода в нее вносят сахарозу. При организации первых производств лимонной кислоты сырьем служил кристаллический свекловичный сахар. В 1950-е гг. на заводах в нашей стране он был заменен на


свекловичную мелассу (отход сахарного производства), которая со­держит от 43 до 49 % сахарозы, отличается сложностью химического состава и объединяет большое количество микроэлементов, в первую очередь железо, угнетающее образование кислоты грибом. Поэтому перед введением в среду мелассу необходимо освободить от ионов металлов. В США это осуществляется с помощью катиоиообменных смол. В России обычно применяется обработка мелассы желтой кро­вяной солью (K4Fe (CN)6) с последующим кипячением раствора. В результате соли железа и других тяжелых металлов осаждаются, и их удаляют из раствора сахара.

Подготовленные стерильные кюветы заполняют стерилизованной средой (высота слоя жидкости — 12 см), которую засевают спорами гриба. Конидии, нанесенные па поверхность питательного раствора, прорастают, образуются мицелий гриба и прочная пленка, покрываю­щая всю поверхность среды. Максимальная интенсивность роста ми­целия наблюдается примерно на 4-е сут, что сопровождается актив­ным тепловыделением и образованием СО2. В процессе ферментации происходит постепенное нарастание общей кислотности. Начальное значение рН среды — 6,8 — 7,0 — снижается в течение первых трех суток до 4,5, а к концу процесса — до 3,0.

Активность кислотообразования грибной пленки, небольшая вна­чале, достигает максимума на 5 — б-е сут (100 — 105 г лимонной кислоты на 1 м2 пленки в час) и далее удерживается на высоком уровне (60 — 50 г кислоты на 1 м2 в час). Ферментацию можно продлить, доливая в кюветы раствор сахара или подводя под пленку свежую среду. Различают три основных способа ведения процесса: бессменный, сменный и доливной.

При бессменном способе рост и кислотообразование гриба проис­ходят на одной и той же питательной среде, содержащей минеральные соли и источник углерода. Последний (кристаллический сахар или меласса) вносится в питательную среду в количестве, необходимом для обеспечения нормального роста и активного кислотообразования гриба.

Сменный способ культивирования часто называют методом гото­вых пленок. Пленку гриба выращивают на питательной среде, содер­жащей минеральные соли и углевод. По окончании его роста пита­тельный раствор из-под пленки сливают, а ее промывают стерильной водой и подводят под нее новую среду для кислотообразования, обыч­но содержащую углевод, но лишенную минеральных соединений. Та­кой способ культивирования может быть односменным или много­сменным. В первом случае после удаления питательного раствора под готовую пленку еще раз подливают новый раствор для кислотообра­зования, имеющий повышенную концентрацию сахара, и там он нахо­дится сравнительно длительное время (4 — 6 сут). При многосмен­ном методе переработанные растворы несколько раз в течение цикла сливают и заменяют новыми. Частота смены зависит от активности грибной пленки.


Способ долива — один из наиболее часто используемых для удлинения цикла ферментации. Через 6 — 7 сут от его начала, когда содержание остаточного сахара в растворе снижается до 3 — 4 %, подливают свежий раствор мелассы (без питательных солей) в коли­честве 30 — 35 % начального объема. В результате продолжитель­ность цикла ферментации увеличивается с 8 — 9 до 12 сут.

При получении лимонной кислоты поверхностным способом од­ним из важнейших факторов является воздушный режим в камерах, т. е. аэрация, температура и влажность.

На стадии роста мицелия считается необходимым поддерживать температуру питательного раствора на уровне 34 — 36 °С и подавать 3 — 4 м3 воздуха в час на 1 м3 культу рал ы-юй жидкости. Это количе­ство увеличивают по мере его развития. Когда гриб усиленно проду­цирует кислоту и выделяет много тепла, объем воздуха, подаваемого в камеру, повышают до 15 — 18 м33 в час, а температуру среды под­держивают на уровне 28 — 34 °С.

В заводских условиях при использовании в качестве продуцента А. пгдег Р-1 дан А. пгдег Р-3 концентрация лимонной кислоты в конце процесса достигает 150 — 200 г/л ферментационного раствора. Ли­монная кислота составляет 96 — 99 % от общей суммы кислот, а выход ее равен 85 — 91 % от внесенного сахара.

После окончания ферментации культуральную жидкость из-под мицелия сливают и переводят для выделения лимонной кислоты в химический цех. Пленки гриба собирают и используют для получе­ния содержащегося в них фермента — пектииазы, либо высушивают и применяют в качестве добавок в корм для скота и птицы.

Глубинное культивирование. Этот относительно молодой метод производства лимонной кислоты обладает многими преимуществами по сравнению с более ранним методом поверхностного культивирова­ния. Его применение позволяет повысить эффективность использова­ния промышленных площадей, увеличить масштабы производства, ме­ханизировать трудоемкие работы и почти полностью автоматизиро­вать технологический процесс получения кислоты.

Однако при сравнении технологии и экономичности поверхност­ного и глубинного способов получения лимонной кислоты предпочте­ние чаще отдается первому, поскольку в этом случае себестоимость продукта и расход электроэнергии значительно ниже.

В настоящее время оба метода применяют в промышленном про­изводстве лимонной кислоты, причем одни фирмы предпочитают ста­рое традиционное поверхностное культивирование, а другие — погру­женное. В России пользуются и тем и другим.

Штаммы А. пгдег, выступающие в качестве продуцентов лимонной кислоты при поверхностном методе, непригодны для использования в условиях глубинного культивирования. Здесь применяют специ­ально селекционированные природные штаммы или мутанты. В Рос­сии используют мутантный штамм А. пгдег № 288/9, который сохра-


пяется в виде конидий, отделенных от мицелия («споровый коисерв»). Перед ферментацией их смешивают с активированным углем или таль­ком. Способ подготовки спорового материала такой же, как для про­дуцента, используемого при поверхностном культивировании. Про­цесс ферментации включает два этапа: 1) рост мицелия в посевном аппарате; 2) рост мицелия и кислотообразование в основном фермен­таторе. В качестве источника углерода при существующем методе глубинного культивирования лимонной кислоты используют мелассу, освобожденную от ионов Fe, Mn и других металлов путем обработки ферроциаиидом калия.

В предварительно простерилизоваиный посевной аппарат (объем которого составляет 1/10 объема основного ферментатора) загружа­ют питательную среду для подращивания посевного материала, содер­жащую 3 — 4 % сахара, затем через инокулятор вносят суспензию спор гриба. Сразу после засева в ферментатор подают стерильный воздух и включают в работу мешалку. Прорастание спор и формиро­вание мицелия гриба происходят при непрерывном продувании воз­духом через культуральпую жидкость и ее перемешивании. Темпера­тура среды поддерживается около 32 °С. Через 20 — 36 ч выращива­ния сформированный в виде гранул мицелий гриба вместе с культу-ралыюй жидкостью передается по посевной линии в заранее подго­товленный основной ферментатор.

Основной процесс в производственном ферментаторе продолжа­ется 5 — 7, а в некоторых случаях до 10 сут при непрерывной аэрации среды и ее перемешивании. Исходная среда для ферментации имеет низкую концентрацию сахара (3 — 4 %). Более высокая концентра­ция мелассы не может быть использована из-за ее высокой буферпо-сти и создания рН культуральной среды, неблагоприятного для син­теза лимонной кислоты. По мере потребления образовавшимся мице­лием гриба сахара из среды производится подлив специально подго­товленного концентрированного (25 — 28 % по сахару) раствора ме­лассы. Обычно это осуществляется три раза из расчета доведения конечной концентрации сахара в культуральной жидкости до 12 — 15 %. В конце ферментации количество лимонной кислоты достигает 50 — 120 г (в зависимости от качества мелассы, а также активности штамма) и составляет 80 — 95 % общей суммы кислот. Когда актив­ность кислотообразоваиия падает, процесс прекращают. Культураль-ный раствор освобождают от мицелия фильтрацией или другим спо­собом и передают в химический цех для выделения и последующей кристаллизации лимонной кислоты. Ее извлекают в виде трудно ра­створимой при высокой температуре соли кальция. Для получения цитрата кальция к отфильтрованному культуралыюму раствору до­бавляют хлористый кальций (2,5 — 3,0 % от количества кислоты), раствор нагревают до 100 °С и нейтрализуют известковым Са(ОН)2 или меловым (СаСО3) молоком до рН, равного 6,8 — 7,0. Выпавший в осадок трехкальциевый цитрат отфильтровывают, промывают горя-


чей водой и разлагают серной кислотой. Лимонная кислота полно­стью освобождается и переходит в раствор, а остающиеся в осадке гипс и оксалат кальция удаляют фильтрацией. Раствор после ряда дополнительных стадий очистки упаривают под вакуумом и проводят кристаллизацию продукта. В продажу поступает кристаллическая ли­монная кислота. „

Механизм биосинтеза

Лимонная кислота образуется Л. niger (и другими грибами) в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) в результате конденсации окса-лоацетата и ацетил-КоА, осуществляемой цитрат-сиитазой.

Необходимые для реакции оксалоацетат и ацетил-КоА образуют­ся из двух молекул пирувата: одна подвергается декарбоксилирова-нию с образованием ацетил-КоА, вторая — карбоксилируется, давая оксалоацетат. Пируват образуется по фруктозобисфосфатиому пути (пути Эмбдеиа, Мейргофа—Парнаса), все ферменты которого, а также пируватдегидрогеназа, пируваткарбоксилаза и цитрат-синтаза обна­ружены у A niger. В результате рассмотренных реакций одна моле­кула сахара (С5Н12Об' превращается в одну молекулу лимонной кис­лоты (СбН8О7). Экспериментально получаемый выход последней не-размножающимися клетками Л. niger близок к теоретическому (95 — 98%).

Полагают, что аконитат-гидратаза (аконитаза) и изоцитрат-дегид-рогеыаза, ответственные за метаболизм лимонной кислоты в ЦТК, хотя и присутствуют в клетках гриба в период ее синтеза, однако их актив­ность ограничена дефицитом ионов металлов (Fe, Mn), низким значе­нием рН среды, а также рядом образовавшихся метаболитов. Акони­тат-гидратаза — железопротеин: для ее активации необходим ион Fe2+, а ингибитором фермента является Н2О2, накапливающийся в Fe-де-фицитных клетках гриба. В отношении изоцитратдегидрогеназы уста­новлено, что ферроцианид калия ингибирует этот фермент, в связи с чем становится понятным положительный эффект присутствия из­бытка данной соли в среде на процесс накопления кислоты. Другим ее ингибитором служит лимонная кислота, накапливающаяся в клет­ках в высокой концентрации и угнетающая активность фермента.

Таким образом, представления в отношении причин сверхсинтеза грибами лимонной кислоты можно суммировать следующим образом. Лимонная кислота — обычный метаболит ЦТК и в небольшом коли­честве присутствует в клетках разных микроорганизмов. Некоторые грибы (в первую очередь A. niger) способны синтезировать огромные количества этой кислоты. Ее сверхсинтез происходит при лимитиро­вании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточном содержании источника углерода.

В условиях лимитирования роста гриба недостатком одного или нескольких минеральных компонентов (Fe, Mn, N, Р или S)после


полного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в его клетках начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду. Она, однако, не может полностью метаболизироваться в ЦТК из-за ингибирования ею ряда ферментов (аконитат-гидратазы, изоцитратдегидрогеназы и, возможно, сс-кетоглутаратдегидрогеиазы).



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2022-12-31 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: