ПРОИЗВОДСТВО АМИНОКИСЛОТ ПРИ ПОМОЩИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Аминокислоты, из которых состоят белки, являются L-a-амино-или иминокислотами. Мы привыкли считать аминокислоты структур­ными элементами белков, но они находят применение как пищевые добавки, приправы, усилители вкуса, как сырье для изготовления пар­фюмерной и фармацевтической продукции и при производстве дру­гих веществ. Их можно получать как из природных продуктов (глав­ным образом при гидролизе белков растений), так и путем химическо­го, микробиологического или ферментативного синтеза. Если хими­ческий синтез дает рацемат, который требует дальнейшей обработки, то последние два метода позволяют получить оптические чистые аминокислоты.

Основным условием протекания большинства производственных процессов с участием микроорганизмов является изменение условий среды: именно за счет этого достигается синтез избыточных коли­честв желаемого продукта. Дисбаланса в метаболизме можно добить­ся путем эмпирического изменения таких факторов, как концентрация субстрата, рН, концентрация продукта, или же путем установления критических уровней содержания других веществ (ионов металлов, органических добавок) в среде. Для получения больших количеств были выработаны новые способы изменений метаболизма у организ­мов-продуцентов, направленных на увеличение выхода промежуточ­ных продуктов, образование которых в иных условиях находится под строгим метаболическим контролем.

Для производства аминокислот бактерии стали использоваться с начала 50-х гг. XX в. Свойства штаммов постоянно улучшали генети­ческими методами, выделяя ауксотрофиые мутанты и мутанты с изме­ненными регуляториыми свойствами. Чтобы обеспечить образование аминокислот в больших количествах, в любом случае необходимо из­менить систему регуляции обмена. Для этого можно либо стимулиро­вать потребление субстрата в некоторых путях биосинтеза и выделе­ние аминокислот в среду, либо подавить побочные реакции и процес­сы деградации аминокислот.

Производство L-глутамата, L-валина, 1),1.-аланипа, L-глутамина и L-пролииа при участии диких штаммов бактерий основано либо на

использовании присущих последним особенностей метаболизма, либо на стимуляции образования аминокислот в ответ на изменение усло­вий внешней среды. На это способны бактерии многих родов (напри­мер, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Micro-bacterium, Escherichia), причем они настолько продуктивны, что про­изводство становится рентабельным. Так, виды Corynebacterium или Brevibacterium, выращиваемые на углеводном сырье (гидролизат крахмала, мелассы из сахарного тростника и свеклы), на этаноле или ацетате при наличии достаточного количества биотина в среде спо­собны синтезировать до 30 г/л глутамата. Для накопления этой ами­нокислоты важным условием является полное или частичное подав­ление активности а-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование продукта увеличивается при добавлении Р-лактамных антибиотиков (пеницил­лина, цефалоспорина С), поверхностно-активных веществ и жирных кислот. Влияние двух последних агентов обусловлено увеличением проницаемости клеточных мембран для глутамата, которая зависит от внутриклеточной концентрации жирных кислот и липидов. Путем изменения условий среды процесс ферментации, в ходе которого по­лучается L-глутамат, может быть переключен на синтез L-глутамина или L-пролина. При высокой концентрации биотина и ионов аммо­ния создаются благоприятные условия для образования L-пролина, а при больших концентрациях аммония и ионов цинка в слабо кислой среде усиливается синтез L-глутамина. Л^-аланин, видимо, образует­ся в реакции трансаминирования при участии пиру вата, затем он под­вергается рацемизации ферментом аланинрацемазой.

Ауксотрофные мутанты не могут образовывать ингибиторы соот­ветствующего метаболического пути, работающие по принципу отри­цательной обратной связи, так как у них отсутствует определенная ключевая ферментативная реакция. Поэтому при выращивании му-тантного штамма в среде с минимальной концентрацией необходимого питательного ингредиента они способны образовывать избыточные количества вещества-предшественника или близких к нему метаболи­тов блокированного пути. Так, на первом этапе в цепи биосинтеза L-аргинина у Corynebacterium glutamicum ингибирование происхо­дит по механизму обратной связи самим конечным продуктом, и образо­вание соответствующих ферментов подавляется им же (рис. 11). У цитруллинового ауксотрофа этой бактерии отсутствует фермент, на­зываемый орнитинкарбамоилтрансферазой, который катализирует пре­вращение орнитина в цитруллин на одном из промежуточных этапов биосинтеза L-аргинина. Синтез аргинина не идет, что приводит к сня­тию ингибирования по принципу обратной связи со всех ферментов этого пути и накоплению избытка орнитина. Ауксотрофные мутанты находят применение и в тех случаях, когда необходимо синтезиро­вать соединения, являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей метаболических реакций. Так, L-аспартат является общим предшественником для L-лизина, L-треонина, L-метионина и L-изо-

лейцина. Первая реакция в процессе образования всех этих амино­кислот катализируется аспартокиназой, активность которой может быть ингибирована по механизму обратной связи при совместном действии L -лизина и L -треонина. У мутантов, ауксотрофных по гомосерину или треонину/метионину, существенно снижается внутриклеточная концентрация L -треонина, что снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет клеткам накапливать L -лизин.

Глюкоза

АТФ

N-Ацетил глута-мат

N-ацетилглутамилфосфат

N-Ацетил глутамат семиальдегид

Цетруллин

Аспартат, ATP

Аргининсукцинат" w-n. ■*• Аргинин

Фумарат

Ингибирование аргинином по механизму обратной связи

Репрессия аргинином по механизму обратной связи

Рис. 11. Биосинтез 1-аргинина

Получить ауксотрофные мутанты, способные накапливать конеч­ные продукты неразветвленных цепей биосинтеза, например L -арги­нин, невозможно. В таких случаях приходится отбирать те из них, у которых частично нарушена регуляция биосинтеза, что позволяет по­лучить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты изве­стны как регуляторные; их отбирают по устойчивости к аналогам аминокислот или же среди ревертантов ауксотрофов. В основе ис­пользования первых лежит их сходство с природными аминокисло­тами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей природной аминокисло­ты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных, работаю­щих по принципу обратной связи ингибиторов ферментов, обеспечи­вающих биосинтез природных аминокислот, и одновременно подавля­ют процесс их включения в белки. Появление мутантов, устойчивых к ним, означает, что регуляторные ферменты соответствующего пути обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Так, серосо­держащий аналог лизина 5-(2-аминоэтил)-1-цистеин является у Brevi-bacterium flavum ложным, действующим по принципу обратной связи ингибитором аспартокиназы. Устойчивые к его действию мутанты вы­рабатывают фермент, который в 150 раз менее чувствителен к ингиби-рованию по механизму обратной связи, чем фермент исходного штам­ма, и в результате продуцируют до 33 г/л лизина. Для увеличения выхода можно воспользоваться как ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно. Так, у Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum сверхпродукции L -треонина не наблюдается, поскольку происходит сочетанное ингибирование по механизму об­ратной связи аспартокиназы и L -треонином, и L -лизином, a L -треонин ингибирует и гомосериндегидрогеназу. Мутант, устойчивый к анало­гу треонина, а-амино-а-оксивалериановой кислоте, синтезирует в избы­точном количестве треонин, так как ферменты его, ингибированные этой аминокислотой, десенсибилизированы. Принимающие участие в синтезе треонина гомосериндегидрогеназа и киназа также ингибиру-ются L-метионином, и поэтому ауксотрофы по метионину образуют L -треонин с еще большим выходом.

Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции, прово­дя при этом отбор отдельных мутаций, вызывающих полное рассог­ласование регуляторных механизмов, а затем объединяя эти призна­ки путем котрансдукции. Таким способом у одного штамма последова­тельно может быть закреплена устойчивость к нескольким аналогам.