Производство аминокислот из биосинтетических предшественников

Использование предшественников при производстве аминокислот позволяет успешно преодолевать метаболический контроль, осуществ­ляющийся по механизму обратной связи и репрессии. Рассмотрим

процесс синтеза L-лейцина из L-треонина через а-кетобутират. Пер­вый фермент в этом пути биосинтеза, гидратаза, у Serratia marcescens ингибируется L-изолейцином по механизму обратной связи, чего не происходит с индуцированной D-треонингидратазой при добавлении в среду D-треонина. Поэтому синтез L-изолейцина из него может миновать метаболический контроль. С другой стороны, для того чтобы обойти последний, можно использовать предшественники, превращае­мые в ходе обмена в кетобутират (например, а-амиио-, сс-бром- и а-гидроксибутират); точно так же при участии гидроксиметилтранс-феразы и в присутствии достаточного количества метилентетрагидро-фолата из предшественников глицина можно получать L -серии. В качестве поставщиков С-1 могут выступать глицин, формальдегид, фор-миат, саркозин, холин или метионин. При наличии в среде глицина, глюкозы и метанола метиониновый ауксотроф Artrobacter globiformis образует до 5,2 г/л L-серина. Для такой конверсии, а также для обра­зования L-глутамата, L-метионина и ароматических аминокислот мо­гут использоваться и другие штаммы растущих на метаноле бактерий. Остановимся на том, каковы роль и ожидаемые преимущества при­менения ферментов при синтезе аминокислот. Эти процессы бывают одно- и многостадийными, а используемые для их осуществления ме­тоды весьма разнообразными: от применения in situ интактных, но не растущих организмов до иммобилизованных препаратов. В этой свя­зи целесообразно рассмотреть пять классов ферментов.

1. Гидролитические ферменты (или гидролазы), например, L-a-ами-
но-£-капролактамлиаза (синтез L -лизина) или 2-аминотиазолин-4-кар-
боксилатгидролаза (синтез L-цистеина). Чтобы можно было исполь­
зовать неочищенные ферменты, целые клетки обрабатывают поверх­
ностно-активными веществами, вызывающими изменение проницае­
мости. Кроме того, могут быть получены мутанты, у которых искомый
продукт не вовлекается более в обмен веществ.

2. Лиазы. Эти ферменты часто используются в реакциях дезами-
нирования. Так, для образования L-аспарта из фумарата аммония мо­
жет применяться (в обратной реакции) аспартаза, или L-аспартатам-
миаклиаза. В качестве доноров аммония могут, кроме того, выступать
гидразин или гидроксиламин. Сходным образом L-фенилаланинам-
миаклиаза может катализировать распад L-фенилаланина с образо­
ванием трдмс-коричной кислоты и аммиака. Хотя обычно равновесие
в этих реакциях сдвинуто в сторону распада, при высоких концентра­
циях аммонийных ионов начинают преобладать процессы синтеза.

3. Ферменты, содержащие пиридоксальфосфат. Это обычные ко-
ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот. Они катализи­
руют множество реакций: рацемизацию, трансамииирование, декар-
боксилирование, замещение, элиминацию и являются своего рода уни­
версальными. По-видимому, роль этих коферментов состоит в актива­
ции аминокислот, что облегчает их взаимодействие с апоферментом.
Мы рассмотрим здесь лишь несколько ферментов из этой группы.

J34

Так, L-тирозинфеноллиаза (Р-тирозиназа) катализирует реакцию Р-элимииации, в которой тирозин распадается с образованием пиру-вата, фенола и аммиака. При оптимальных условиях Erwinia herbicola может синтезировать очень много этого фермента (до 10 % от раство­ренного белка). Его используют для синтеза тирозина: в иммобилизо­ванной форме он применялся для непрерывного его производства — субстратная специфичность такова, что он может также осуществлять реакцию Р-замещения между £),£-серином и пирокатехолом, в резуль­тате которой образуется L-ДОФА.

Примером широко распространенного в природе фермента, осу­ществляющего дезаминирование, может служить L-триптофаниндол-лиаза (триптофаназа). Она катализирует реакции а,р-элиминации и р-замещения, а также характеризуется широкой субстратной специ­фичностью (L-триптофан, L-цистеин, 5-метил-£-цистеин, р-хлор-1-ала-нин, L-серии). Действие ее может быть обращено, и тогда она будет способствовать синтезу L -триптофана из индола, пиру вата и аммиака. Примером индуцибельного фермента является L-метионин-у-лиаза: она катализирует реакцию элиминации, где субстратами могут быть раз­нообразные аминокислоты, включая производные L-метионина и L-ци-стеина. Первый расщепляется с образованием метантиола, ос-кетобу-тирата и аммиака. Когда фермент работает на синтез, его можно при­менять для производства новых серосодержащих аминокислот на основе алкантиолов и арилтиоспиртов. Он может также расщеплять селенметионин. Использование селенолов в обратных реакциях за­мещения, идущих с образованием гомоцистеинов, содержащих селен вместо серы, — это первый случай, когда селен удалось включить в состав аминокислот.

Эту лиазу можно применять для синтеза меченых аминокислот.

4. Дегидрогеназы аминокислот, например, лейцин- и аланин-дегид-
рогеназы. Эти ферменты катализируют обратимые реакции дезами-
нирования. Их применяют в непрерывных процессах синтеза амино­
кислот из соответствующих кетоаналогов. В мембранном реакторе де­
гидрогеназы аминокислот удерживаются ультрафильтрующей мем­
браной и используют в своей работе один и тот же пул HADH, кото­
рый сохраняется в реакторе, так как ковалентно связан с полиэтилен-
гликолем. Регенерация его в ходе процесса осуществляется с помо­
щью формиатдегидрогеназы.

5. Глутаминсинтаза. Этот фермент катализирует АТФ-зависимую
реакцию аминирования глутамата, которая была сопряжена со сбра­
живанием сахара дрожжами. Высвобождающаяся при брожении энер­
гия используется для синтеза глутамина. При распаде фруктозо-1,6-
дифосфата, образовавшегося при сбраживании глюкозы, продуциру­
ется АТР, которая необходима для энергоснабжения эндергонической
реакции, катализируемой синтазой. При использовании бесклеточного
экстракта пекарских дрожжей и глутаминсинтазы Gluconobacter subo-
xydans из глюкозы, глутамата и ионов аммония в качестве субстратов
с высоким выходом был получен глутамин.

ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКА

Структура питания человечества в целом, в том числе и населения нашей страны, далеко не идеальна, причем наиболее дефицитным ком­понентом пищи является белок, особенно высокой питательной ценно­сти. Его традиционные источники — продукты животноводства и растениеводства — не покрывают все возрастающую потребность в белковой пище, особенно увеличившуюся в связи с интенсивным при­ростом населения. Альтернативным источником этого вещества могут служить различные микроорганизмы — дрожжи, высшие съедобные грибы, некоторые микроводоросли и т. д.

Микробиологическое производство белка налажено относительно недавно. Оно обладает рядом преимуществ по сравнению с традици­онными способами получения белковой пищи (животноводством и растениеводством): не требует посевных площадей, не зависит от кли­матических и погодных условий, поддается точному планированию и высокому уровню автоматизации, позволяет получать продукцию стан­дартного качества. Продукты микробиологического синтеза можно назвать новыми видами кормов и пищи. Разнообразие микроорганиз­мов и типов их питания позволяет легко маневрировать в использо­вании различных видов сырья для биосинтеза.