| Функции | Млекопитающие | E. coli |
| Длина поли(А)-последовательностей, нт | 80–200 | 14–60 |
| Уровень полиаденилирования отдельных мРНК, % | ~100 | 2–50 |
| Локализация сайтов полиаденилирования | Ниже консенсусной последовательности AAUAAA | Любые доступные 3’-OH-концы мРНК |
| Функции: | ||
| стабильность мРНК | Стабилизация мРНК без участия 3’-концевых структур типа "стебель–петля" | Дестабилизация мРНК, обладающих 3’-концевыми структурами типа "стебель–петля", возможная стабилизация мРНК без таких структур |
| трансляция | Специфический контакт с белком PABP, необходимый для взаимодействия мРНК с 40S субчастицами рибосом | Связывание рибосомного белка S1, возможно, необходимое для взаимодействия мРНК с 30S субчастицами рибосом |
| репликация плазмид | Не участвует | Деградация антисмысловой РНК, ингибирующей репликацию плазмид типа ColE1 |
Сплайсинг. Мозаичная интрон-экзонная структура генов эукариот предполагает функционирование механизма, который бы распознавал интроны в предшественниках РНК и с высокой точностью удалял их. Действительно, в 1977 г. такой процесс был обнаружен, он получил название сплайсинга (от англ. splice – соединять концами) и с тех пор интенсивно исследуется.
Удаление последовательностей интронов с помощью сплайсинга происходит в ядрах эукариот сразу после завершения синтеза пре-РНК. В сплайсинге, как правило, участвуют особые рибонуклеопротеиновые (РНП)-частицы – малые ядерные РНП (мяРНП), в состав которых входят мяРНК U1–U6 и многочисленные белки. Эти РНП-частицы на стыках интронов и экзонов образуют функциональный комплекс, получивший название сплайсомы. Однако не все интроны для своего удаления требуют функционирования такого сложного аппарата. В частности, интроны предшественников тРНК у эукариот удаляются с участием более простого набора ферментов, а для вырезания некоторых интронов не требуется никаких дополнительных компонентов, кроме самих предшественников РНК. Последний процесс получил название аутосплайсинга (self-splicing). Поскольку механизмы химических реакций, происходящих в ходе аутосплайсинга, реализуются и при функционировании сплайсомы, они будут рассмотрены более подробно в следующем разделе.
|
|
В заключение этого краткого введения определим с помощью приведенной ниже схемы термины, которые будут использоваться при обсуждении механизмов сплайсинга.
5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
сплайсинга разветвления сплайсинга
¯ ¯ ¯
5’– éэкзон 1ù GUAUGU__...__UACUA A C__...__(Py)nAG éэкзон 2ù –3’
ï-----------------------Интрон---------------------®ê
На схеме изображен интрон, соединяющий два соседних экзона в предшественнике мРНК дрожжей. В общих чертах та же структура характерна и для пре-мРНК высших организмов. Места соединения интронов и экзонов, в которых происходит разрыв фосфодиэфирных связей пре-мРНК во время сплайсинга, в зависимости от их положения в интроне называют 5’- или 3’-концевыми сайтами сплайсинга. Полипиримидиновая последовательность (Py)n перед 3'-концевым сайтом сплайсинга существенна для правильного вырезания интронов. Остаток аденозина в консервативной последовательности нуклеотидов интрона, расположенный ближе к его 3’-концу, получил название точки разветвления (branch point). Именно с этим аденозином ковалентно соединяется 5’-конец интрона, освобождающийся на первом этапе сплайсинга с образованием структуры типа "лассо" (lariat) (см. ниже). Первичная структура указанных сайтов мало консервативна в генах, кодирующих ядерные пре-мРНК, и может значительно варьировать даже у интронов одного и того же организма. В зависимости от механизма вырезания интронов и особенностей их пространственной структуры различают интроны групп I, II и III, интроны ядерных РНК, а также твинтроны – интроны, расположенные внутри интронов.
|
|
Аутосплайсинг интронов групп I, II и III. Открытие интронов, удаляющихся из пре-РНК в результате аутокаталитического процесса – аутосплайсинга, имело далеко идущие последствия для развития фундаментальных и прикладных исследований в молекулярной генетике и породило целое направление с использованием рибозимов (подробнее см. раздел 9.2). Такие интроны впервые были обнаружены в органеллах высших организмов, но вскоре было продемонстрировано их широкое распространение в природе. Исследование молекулярных механизмов аутосплайсинга показало, что хотя все вышеупомянутые интроны в сплайсинге используют одни и те же реакции трансэтерификации:
О- О-
½ ½
R–OH + R’–O–P–OR’’ ® R–O–P–OR’’ + R’–OH,
║ ║
О О
детали механизмов для интронов групп I, II и III различны.
На рис. I.15, а,б изображены структурные особенности интронов I–III групп. Интроны группы I образуют наиболее сложные вторичные и третичные структуры. Они обнаружены в предшественниках РНК простейшего Tetrahymena thermophila и удаляются из них с использованием приведенного в табл. I.10 механизма.
Таблица I.10