В разделе 1.3 уже кратко обсуждался петельно-доменный уровень структурной организации хромосом эукариот, который отражает разделение интерфазных хромосом на дискретные домены по функциональному признаку. Наибольшее число экспериментальных данных в пользу наличия таких функциональных доменов было получено в исследованиях хромосом дрозофилы в связи с мозаичным эффектом положения, в которых использовались методы генетического анализа в сочетании с цитологическими наблюдениями политенных хромосом. Феномен эффекта положения и молекулярные механизмы, лежащие в его основе, будут более подробно рассмотрены в разделе 3.2.4. Говоря коротко, эффект положения заключается в том, что перенос активно транскрибируемых генов к неактивным гетерохроматизированным участкам хромосом часто сопровождается значительным подавлением транскрипционной активности генов в их новом положении на хромосоме. Возможен поиск генов, ингибирующих или усиливающих эффект положения генов-репортеров, уровень экспрессии которых легко устанавливается фенотипически, например по изменению интенсивности окраски глаз. Многие из идентифицированных таким образом генов кодируют структурные компоненты хроматина или ферменты, ковалентно модифицирующие эти компоненты.
Эффект положения рассматривается в настоящее время в качестве универсального явления, характерного для всех эукариотических хромосом. Он наглядно демонстрирует наличие в интерфазных хромосомах высокоупорядоченной доменной структуры, тесно связанной с транскрипционной активностью соответствующих участков генома. Распределение участков хроматина с разным уровнем конденсированности в интерфазных хромосомах упорядочено и, по-видимому, является видовым признаком организма. Имеются указания на то, что структурные компоненты конденсированного хроматина оказывают влияние на пространственное расположение соответствующих частей хромосом в ядре. Следовательно, такая их микрокомпартментализация может играть важную роль в регуляции экспрессии генов.
|
|
Уже в ранних цитологических экспериментах (С. Рабл, 1885 г.) было показано, что теломерные участки хромосом клеток слюнных желез саламандр располагаются вблизи ядерной оболочки. В настоящее время установлена локализация на периферии ядер теломер политенных хромосом дрозофилы, а также теломерных участков хромосом Schizosaccharomyces pombe в фазе G2 клеточного цикла. С помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии продемонстрировано, что перинуклеарную локализацию теломер дрожжей S. cerevisiae обеспечивают, по крайней мере, два белка – Sir3 и Sir4 (silent information regulators), которые также требуются для наследуемой инактивации генов в специфических доменах хромосом, расположенных в локусе, определяющем тип спаривания у дрожжей, и вблизи теломерных последовательностей. В такого рода экспериментах была установлена связь между ядерной локализацией конкретных участков хромосом и их транскрипционной активностью.
В отличие от теломерных участков хромосом, активно экспрессирующиеся гены локализуются преимущественно во внутренних частях интерфазных ядер. При этом, по мнению Д.Б. Лоуренса и соавторов (1993 г.), отдельные гены внутри ядер располагаются упорядоченно. В частности, было установлено, что активно транскрибируемые гены вируса Эпштейна–Барр и онкогена neu находятся в разных местах внутренних 50% ядерного объема, а ген дистрофина – вблизи ядерной оболочки. В этой серии экспериментов три неактивных гена, кодирующих альбумин, тяжелую цепь сердечного миозина и нейротензин, локализовали в составе конститутивного гетерохроматина на периферии ядер или вблизи ядрышка. Используя микрооблучение ультрафиолетовым светом и гибридизацию с зондами, показали, что отдельные хромосомы занимают внутри ядра дискретные, хотя и обширные, территории. Компоненты аппарата сплайсинга обнаруживают в ядрах на периферии территорий, занимаемых индивидуальными хромосомами, так же как и треки синтезируемой РНК (см. ниже). В соответствии с моделью Т. Кремера (1993 г.), внутриядерное пространство между территориями, занимаемыми индивидуальными хромосомами, представляет собой единый компартмент, в котором происходят транскрипция, сплайсинг, созревание транскриптов и их транспорт. Этот компартмент тесно ассоциирован с активно транскрибируемыми генами, которые располагаются на периферии хромосомных территорий в составе выступающих петель хроматина. Несмотря на большую функциональную важность обсуждаемого вопроса, истинная природа интерфейса между активными генами отдельных хромосомных территорий и межхроматиновым компартментом остается неясной из-за слабого понимания пространственной структуры ДНК на высших уровнях ее упаковки в хромосомах.
|
|
Ядрышко
Структурно-функциональная организация ядрышка (nucleolus) еще более наглядно иллюстрирует концепцию функциональной компартментализации ядра эукариотических клеток. В этой части ядра происходят транскрипция рибосомных генов, процессинг предшественников рРНК и сборка прерибосомных частиц из рибосомных белков и рРНК. Механизмы формирования ядрышка, приводящие к образованию внутри ядра этой дискретной и легко обнаруживаемой структуры, в настоящее время не ясны. В соответствии с одной из простых гипотез, ядрышко рассматривают как нуклеопротеиновый комплекс, спонтанно появляющийся в результате объединения регуляторных белково–нуклеиновых комплексов, возникающих на повторяющихся последовательностях рДНК во время их транскрипции. Действительно, гены рРНК человека организованы в виде 250 тандемно повторяющихся последовательностей длиной в 44 т.п.о. каждая, которые вместе с ассоциированными с ними белками формируют сердцевину ядрышка. Оно заполняется другими компонентами во время процессинга рРНК и сборки рибосомных субчастиц.
|
|
Морфологически в ядрышке различают три основные зоны: фибриллярный центр (1), окруженный плотной фибриллярной (2) и гранулярной (3) областями. С помощью специфических антител и гибридизационных зондов было установлено, что в фибриллярном центре ядрышка локализованы гены рРНК, РНК-полимераза I, транскрипционный фактор UBF и топоизомераза I. Полагают, что фибриллярный центр ядрышка является местом сборки регуляторных нуклеопротеиновых комплексов, необходимых для транскрипции генов рРНК. Плотный фибриллярный компонент, окружающий центр ядрышка, представлен растущими цепями предшественников рРНК и ассоциированными с ними белками, участвующими в процессинге. В гранулярной области ядрышка обнаруживают зрелые 28S и 18S рРНК, частично процессированные РНК, а также продукты сборки рибосомных субчастиц. Интермедиаты сборки рибосом представлены частицами диаметром 15–20 нм. Перенос прерибосомных субчастиц к цитоплазме, по-видимому, обеспечивают специфические белки, которые направленно перемещаются от ядрышка к оболочке ядра. Благодаря четко прослеживаемой иерархии в структурно-функциональной организации ядрышка в виде отдельных морфологически различимых компартментов его часто используют в качестве модели функциональной компартментализации синтеза мРНК, ее процессинга и экспорта в цитоплазму.
При этом следует иметь в виду, что наблюдаемая "высокоупорядоченная" пространственная структура ядрышка может быть просто следствием функционирования большого числа генов рРНК, организованных в тандемные повторы, что сопровождается накоплением транскриптов РНК-полимеразы I и продуктов их процессинга в окрестностях активно работающих генов. Структура ядрышка является динамической, а его пространственное расположение и структурные особенности зависят от внутриядерной локализации и уровня активности соответствующих генов рРНК.
Долгое время ядрышко рассматривалось только в обсуждаемом выше аспекте, т.е. как внутриядерный микрокомпартмент биогенеза рибосом, в котором происходят транскрипция рДНК и сборка рибосомных субчастиц из составляющих компонентов. Однако в последнее время начинают появляться данные, указывающие на участие ядрышка в регуляции клеточного цикла.
Даже геном дрожжей содержит ~200 тандемно повторяющихся генов рРНК. При этом не все гены одинаковы в функциональном отношении: транскрибируется лишь половина последовательностей рДНК, а в их воспроизводстве задействовано лишь ~20% имеющихся областей начала репликации. Перенос генов в область рДНК часто сопровождается их репрессией, что, как полагают, является следствием функционирования механизма подавления гомологичной рекомбинации в участках генома, содержащих тандемные повторы. Мутационное нарушение этого механизма сопровождается образованием сотен внехромосомных кольцевых рДНК, которые неравномерно распределяются между дочерними клетками во время митоза. Накопление материнскими клетками внехромосомных рДНК приводит к уменьшению способности клеток делиться. Этот феномен был назван "старением клеток" (cellular aging). Кроме того, складывается впечатление, что ядрышко может регулировать вхождение клеток в мейоз, а также активность фосфатазы Cdc 14, контролирующей прохождение телофазы митоза. Получены данные о том, что повторяющиеся последовательности рДНК ядрышка служат местом сборки большого регуляторного белкового комплекса RENT (regulator of nucleolar silencing and telophase exit), в состав которого входит вышеупомянутая фосфатаза и, как минимум, три других белка, которые и обеспечивают регуляторные функции ядрышка.