Рестриктазы и ДНК-метилазы
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции – рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции. В то же время метилазы используют для ограничения числа сайтов рестрикции и получения более крупных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз.
Классификация рестриктаз. По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз. Ферменты рестрикции типа I представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия ATP, S-аденозилметионина и ионов Mg2+, они не распознают специфические последовательности нуклеотидов и в силу этого не находят широкого применения в генной инженерии. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, требуют для проявления активности наличия в реакционной смеси ATP и ионов Mg2+ и чаще всего используются при молекулярном клонировании. Ферменты типа III также активны только в присутствии ATP и ионов Mg2+ и не проявляют абсолютной зависимости от S-аденозилметионина.
Рис. II.1. Формы разрывов двухцепочечных ДНК, образующихся под действием рестриктаз
а – 5’-выступающие (1), 3’-выступающие "липкие" (2) и "тупые" (3) концы ДНК, образующиеся под действием рестриктаз BamH I, Kpn I и Pvu II соответственно. Стрелками обозначены места разрывов цепей ДНК, пунктирной линией – ось симметрии сайтов рестрикции;
|
|
б – лигирование с потерей сайта рестрикции
Названия рестриктаз складываются из первых букв видовых названий бактерий, в которых они обнаружены, например Eco – E. coli. В том случае, когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят дополнительную букву, например рестриктазы Hinc и Hind выделены из бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы с и d. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида, например Hae I, Hae II и Hae III из H. aegipticus.
Рестриктазы типа II – основной инструмент генной инженерии. Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, а по крайней мере три из них – октануклеотиды. Чем короче олигонуклеотидная последовательность сайта рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной последовательности нуклеотидов, в которой каждый из четырех нуклеотидов представлен с одинаковой частотой (50% А–Т-пар и 50% G–С-пар). Так, случайная тетрануклеотидная последовательность встречается в среднем через каждые 256 п.о. (44), а гексануклеотидная – через каждые 4096 п.о. (46). Однако в природных ДНК распределение нуклеотидов может заметно отличаться от случайного. Например, для эукариотических ДНК характерна низкая частота встречаемости динуклеотида CpG и соответственно сайтов рестрикции, содержащих эти динуклеотиды (рестриктазы Hha I, Hpa II, Taq I, Tha I, Ava I, Hae II, Hind II, SalI, Sma I, Xho I, Xma I). Существенное отклонение частоты встречаемости сайтов рестрикции от ожидаемого при случайном их распределении вдоль ДНК свойственно и хромосомам термофильных бактерий, которым, напротив, свойственно (хотя и не во всех случаях) обогащение по G–С-парам. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа II, характерно наличие в них симметрии второго порядка, т.е. узнаваемые ими последовательности представляют собой палиндромы, например у рестриктазы EcoR I – 5’-GAATTC-3’. Это означает, что нуклеотиды, расположенные в каждой из цепей на равном расстоянии от оси симметрии, комплементарны друг другу. Если точки расщепления противоположных цепей ДНК смещены друг относительно друга в сайте рестрикции, то образующиеся в результате рестрикции концы ДНК содержат выступающие одноцепочечные участки. Поскольку такие участки комплементарны сами себе и друг другу и могут между собой взаимодействовать, их часто называют " липкими" концами. В "липких" концах выступающим одноцепочечным участком может быть как 5’-, так и 3’-конец (рис. II.1, а). Формальным признаком образования 5’- или 3’-выступающих "липких" концов в сайтах рестрикции является расположение точки расщепления цепей ДНК в последовательности, используемой для обозначения сайта рестрикции, слева или справа от оси симметрии соответственно. У некоторых рестриктаз точки расщепления обеих цепей ДНК расположены непосредственно друг под другом в сайте рестрикции. В этом случае после расщепления ДНК "липких" концов не образуется, а получаются так называемые "тупые" концы, в которых нет выступающих одноцепочечных участков ДНК (см. рис. II.1, а). Имеется одно принципиальное функциональное различие между 5’- и 3’-выступающими "липкими" концами – последние невозможно пометить путем их достройки ДНК-полимеразой. Эту особенность следует иметь в виду при выборе рестриктаз для получения рестрикционных фрагментов ДНК, которые предполагается использовать в качестве зондов.
|
|
|
|
При конструировании рекомбинантных молекул полезно помнить, что, хотя рестриктазы BamH I, Bcl I, Bgl II и Xho II узнают разные сайты рестрикции, они образуют одни и те же "липкие" концы, GATC. То же характерно и для группы рестриктаз SalG I, Xho I и Ava I (NCGA). При лигировании (см. ниже) фрагментов ДНК, образованных рестриктазами одной из таких групп, происходит их объединение, но при этом исходные сайты рестрикции теряются, так как в результате образуется новая непрерывная последовательность нуклеотидов (см. рис. II.1, б). Сайты рестрикции для некоторых рестриктаз II типа не являются симметричными. Например, рестриктаза Hga I узнает асимметричную последовательность 5’-GACGC-3’, а одноцепочечные разрывы вносит в противоположные цепи ДНК, отступя вправо на 5 и 10 нуклеотидов соответственно:
5’-GACGC(N)5¯
3’-CTGCG(N)5(N)5¯
Последовательности нуклеотидов образующихся "липких" концов являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Вследствие этого рестрикционные фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием данной рестриктазы, в смеси соединяются друг с другом лишь в строго определенной исходной последовательности, которая задается уникальными последовательностями нуклеотидов в "липких" концах рестрикционных фрагментов ДНК. Например, при расщеплении этой рестриктазой репликативной формы ДНК фага fX174 образуется 14 фрагментов, которые in vitro объединяются в правильную последовательность с образованием инфекционной fX174-ДНК.
Универсальные рестриктазы для одноцепочечных ДНК. На основе рестриктаз, узнающих асимметричные последовательности нуклеотидов, разработана система, позволяющая расщеплять молекулы одноцепочечной ДНК в любой заданной точке. С этой целью синтезируется олигонуклеотид, 5’-концевая часть которого содержит сайт, узнаваемый такой рестриктазой, а последовательность нуклеотидов 3’-концевой части комплементарна участку ДНК, в который необходимо внести эндонуклеазный разрыв. В результате гибридизации олигонуклеотида с одноцепочечной ДНК образуется структура, изображенная на рис. II.2. При этом фермент взаимодействует с сайтом узнавания (участок I), а разрывы вносятся по местам, обозначенным стрелками. Таким образом, положение места эндонуклеазного расщепления будет целиком зависеть от последовательности нуклеотидов участка II синтетического олигонуклеотида, комплементарного ДНК-субстрату.
Рис. II.2. Расщепление одноцепочечной ДНК универсальной рестриктазой
а – синтетический олигонуклеотид; б – одноцепочечная ДНК.
После образования шпильки и гибридизации с одноцепочечной ДНК-мишенью олигонуклеотид образует сайт связывания рестриктазы (участок I) и сайт расщепления ДНК-ДНК-гибрида (участок II). Стрелки указывают места эндонуклеазного расщепления ДНК и олигонуклеотида
Изошизомеры. В клетках разных видов бактерий могут содержаться рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Такие рестриктазы называют изошизомерами. Изошизомеры некоторых рестриктаз с успехом используются для обнаружения метилированных участков ДНК в геноме. Так, рестриктазы Hha I и Hpa II расщепляют неметилированные последовательности GCGC и CCGG соответственно и утрачивают способность к расщеплению, если хотя бы один из остатков цитозина в этих сайтах метилирован. В то же время фермент Msp I (изошизомер Hpa II) расщепляет последовательность CCGG независимо от того, метилированы или неметилированы остатки цитозина в таком сайте. N-Метилирование остатков аденозина в ДНК можно обнаружить с помощью изошизомеров Sau 3A (расщепляет как метилированные, так и неметилированные последовательности GATC), Dpn I (расщепляет только метилированные последовательности GMeATC) и Mbo I (расщепляет только неметилированные последовательности).
Изменение специфичности действия рестриктаз в неоптимальных условиях. Рестриктазы являются высокоспецифическими ферментами. Однако для поддержания этой специфичности in vitro необходимо соблюдать в реакционной смеси оптимальные условия для действия ферментов. При нарушении таких условий у некоторых рестриктаз начинает проявляться вторичная (так называемая штриховая) активность. Так, рестриктаза EcoR I расщепляет последовательность GAATTC при pH 7,3, 100 мМ NaCl в присутствии 5 мМ MgСl2, однако при изменении значений pH, понижении концентрации NaCl или замене ионов Mg2+ на Mn2+, а также в присутствии органических растворителей у фермента появляется тенденция к расщеплению более короткой последовательности AATT (так называемая активность EcoR I). К рестриктазам, обладающим подобными свойствами, относятся также BamH I, Bst I, Bsu I, Dde I, Hha I, Pst I, Sal I, Sst I, Xba I.
Действие рестриктаз на необычные субстраты. Помимо двухцепочечных ДНК многие рестриктазы способны использовать ДНК-РНК-гибриды в качестве субстрата. Это относится, в частности, к рестриктазам EcoR I, Hind II, Sal I, Msp I, Hha I, Alu I, Taq I и Hae III. Некоторые рестриктазы, например Hae III, Hha I и Sfa I, способны расщеплять одноцепочечную ДНК фага fX174, хотя и со значительно меньшей скоростью, чем соответствующую двухцепочечную RF-форму. Такая способность была продемонстрирована для некоторых других рестриктаз, а также ДНК-субстратов. Остается неясным, узнают ли эти рестриктазы истинные одноцепочечные сайты или же последовательности нуклеотидов, заключенные в элементы вторичной структуры.
С развитием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. ниже) часто возникает необходимость расщепления рестриктазами амплифицированных олигонуклеотидов недалеко от их концов, т.е. в условиях, когда сайт рестрикции фланкирован с одного из своих концов одним или несколькими нуклеотидами. В этом случае установлена четкая зависимость способности определенных рестриктаз расщеплять сайты рестрикции от количества фланкирующих сайт нуклеотидов. Данное свойство рестриктаз объясняют, в частности тем, что на самих концах двухцепочечной молекулы ДНК происходит локальное плавление двойной спирали ДНК с образованием коротких одноцепочечных участков, захватывающих сайт узнавания рестриктазами. Частично избежать локальное плавление можно понижением температуры реакционной смеси во время проведения рестрикции таких олигонуклеотидов. Поскольку эти данные имеют большое значение для практической генной инженерии, они суммированы в табл. II.1.
Таблица II.1