Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны стабильно в них существовать, как правило, не превышает нескольких тысяч пар оснований. Большие вставки ДНК в векторных плазмидах нестабильны, и их размеры постепенно уменьшаются по мере увеличения числа раундов репликации таких рекомбинантных плазмид in vivo. Преимущественное делетирование чужеродной ДНК в плазмидах большого размера связано с тем, что в бактериальных клетках селективное преимущество получают те плазмиды, время репликации которых минимально. Поэтому нуклеотидные последовательности ДНК, не участвующие в репликации векторных плазмид, постепенно элиминируются посредством делеций при длительном культивировании рекомбинантных бактерий.
Рис. II.6. Упаковка рекомбинантной фаговой ДНК в фаговые частицы in vitro
Емкость клонирующих векторов была значительно повышена с появлением векторов, сконструированных на основе хромосомы бактериофага l. Получившие широкое распространение векторы серий Charon, lgt11 и EMBL обладают, по крайней мере, двумя существенными преимуществами перед плазмидными векторами. Во-первых, векторы на основе ДНК фага l обладают значительно большей емкостью, в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 5 до 25 т.п.о. Во-вторых, фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток и, следовательно, образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий. Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаговые частицы с упакованными в них рекомбинантными молекулами ДНК, так и все продукты метаболизма зараженных бактериальных клеток, включая белки и ферменты, которые появляются в результате экспрессии клонированных бактериальных генов. Каждая бляшка возникает вследствие развития индивидуальной фаговой частицы, содержащей рекомбинантную ДНК только одного типа, а, следовательно, все фаговые частицы одной бляшки (~1010) представляют собой, как правило, клон идентичных фаговых частиц (они могут различаться в редких случаях за счет мутационных изменений их генома, произошедших в процессе жизненного цикла фага, либо в том случае, если одна бактериальная клетка заражается несколькими фаговыми частицами одновременно). Все это позволяет легко обнаруживать в фаговых бляшках искомые ферментативные активности или последовательности нуклеотидов и идентифицировать клонированные последовательности ДНК. В основе конструирования фаговых векторов лежит несколько простых принципов (рис.II.6). В середине молекулы l-ДНК длиной ~45 т.п.о. расположен участок хромосомы (~15 т.п.о.), который не является необходимым для литического развития бактериофага. Поэтому, в принципе, его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осуществить клонирование фрагмента путем размножения рекомбинантного бактериофага. Поскольку механизм упаковки хромосомной ДНК в фаговые частицы основан на включении ДНК строго определенного размера, рекомбинантные ДНК, содержащие фрагменты клонируемой ДНК, которые не соответствуют оптимальному размеру, не упаковываются и не клонируются. Это позволяет легко освобождаться от фаговых частиц, не содержащих вставки клонируемой ДНК, и оптимизировать процесс клонирования путем снижения в упаковочных экстрактах доли нежизнеспособных фаговых частиц. Процесс упаковки фаговой ДНК в зрелые фаговые частицы осуществляется в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов E. coli, лизогенных по дефектным бактериофагам l. В одном штамме амбер-мутацией инактивирован один из белков фагового капсида (продукт гена E), а в другом – ген A, продукт которого необходим для включения фаговой ДНК в головку бактериофага. Имеются и другие пары лизогенных штаммов E. coli, позволяющие производить упаковку ДНК в фаговые частицы с использованием тех же общих принципов. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов E. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Таким образом, в объединенных экстрактах имеются все компоненты, необходимые для сборки зрелых инфекционных фаговых частиц, в них происходит упаковка рекомбинантной ДНК с эффективностью образования 104–105 фаговых частиц на 1 мкг упаковываемой ДНК. Помимо вышеупомянутых мутаций ДНК l-лизогенов содержат температурно-чувствительную мутацию в репрессоре cI, который инактивируется после переноса лизогенных клеток E. coli на непермиссивную температуру (42o), что сопровождается индукцией профага l и накоплением внутри бактериальных клеток белковых продуктов, необходимых для упаковки ДНК. ДНК профагов также содержит делецию b2, элиминирующую сайт att, необходимый для интеграции фаговой ДНК в бактериальную хромосому. Это предотвращает выход ДНК профага из бактериальной хромосомы, а следовательно, и ее упаковку in vitro. Кроме того, в хромосоме профага имеется мутация, инактивирующая ген S, кодирующий лизоцим, что препятствует преждевременному лизису бактериальных клеток после индукции профага и позволяет сконцентрировать бактериальные клетки перед получением упаковочных экстрактов. И, наконец, бактериальные лизогенные клетки содержат мутацию recA, которая предотвращает гомологичную рекомбинацию между ДНК профага и рекомбинантными ДНК, упаковываемыми в фаговые частицы.
Рис. II.7. Генетическая карта хромосомы бактериофага l-EMBL3
а – расположение генов на хромосоме; б – шкала длины хромосомной ДНК в процентах от длины l-ДНК и т.п.о.; в – участок генома, замещаемый на клонируемый фрагмент ДНК соответствующего размера. S, B и R – сайты рестрикции SalG I, BamH I и EcoR I соответственно
В качестве примера рассмотрим генетическую карту векторной ДНК бактериофага l-EMBL и кратко обсудим возможности этого вектора (рис. II.7). Векторы серии EMBL являются производными ДНК бактериофага l1059. Их хромосомная ДНК длиной в 42364 п.о. содержит центральный сегмент ДНК длиной ~15 т.п.о., который замещается на клонируемый фрагмент ДНК соответствующего размера. При этом в фаговые частицы может быть упакована рекомбинантная ДНК общей длиной в 9–23 т.п.о. Замещаемый фрагмент фаговой хромосомы фланкирован с обоих концов последовательностями полилинкера, содержащего рестриктазные сайты EcoR I, BamH I и SalG I, по которым встраивают клонируемые фрагменты ДНК. При этом во время подготовки вектора к работе нет необходимости отделять "плечи" вектора от центрального фрагмента. Сначала центральный фрагмент ДНК выщепляется рестриктазой по одному из сайтов полилинкера, а затем смесь образовавшихся фрагментов обрабатывается другой рестриктазой, сайт для которой находится в полилинкере. Образующиеся олигонуклеотидные фрагменты полилинкера удаляются при переосаждении ДНК спиртом, а "липкие" концы "плеч" вектора и центральной последовательности получаются некомплементарными друг другу и не могут объединяться в процессе лигирования с образованием исходной формы ДНК вектора.
Космиды и фазмиды
Рис. II.8. Космидный вектор и конструирование клонотеки геномной ДНК на его основе
Как уже упоминалось выше, фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15–25 т.п.о. Однако этого явно недостаточно, чтобы клонировать целиком многие гены животных и растений, длина которых зачастую превышает 35–40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами (рис. II.8). Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos -сайты ДНК фага l. Отсюда происходит название всего типа данных векторов (cosmid). В ДНК нормальных фаговых частиц cos-сайты расположены на концах молекул, они разделяют мономеры фаговой ДНК в конкатемерах, объединяющих несколько соединенных "голова к хвосту" мономеров, которые являются предшественниками зрелых фаговых ДНК перед упаковкой в фаговые частицы. В таких конкатемерах соседние cos -сайты располагаются на расстоянии 35–45 т.п.о. друг от друга и заключают между собой весь фаговый геном. В процессе упаковки cos -сайты узнаются компонентами ферментативной системы и по ним происходит последовательное отделение (отрезание) упакованной в фаговую частицу l-ДНК от остальной неупакованной ДНК конкатемера. Таким образом, наличие cos -сайтов в ДНК является, по существу, единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов l-ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35–45 т.п.о.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине (38–52 т.п.о.) фрагмент чужеродной ДНК и эффективно упакована в фаговые частицы (такова максимальная емкость головки фага). Естественно, что такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной.
Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30–40 т.п.о. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев 105–106 колоний на 1 мкг клонируемой ДНК. При такой эффективности упаковки требуется всего лишь 2–4 мкг клонируемой ДНК для получения полной клонотеки большинства эукариотических геномов.
Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для l-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.