Гены-мишени | Длина micРНК, п.о. | Мишень в гене | Фенотип |
Основной белок миелина | Экзоны | Понижение уровня мРНК на £80%; мыши shiverer | |
ГФРТ | 5'-НТ, экзон 1 и интрон 1 | Понижение уровня мРНК на 20–50%; активность фермента не изменилась | |
» | То же | Эффект отсутствовал | |
y-Последовательность мышиного вируса лейкемии Молони | y-Область | Снижение числа лейкозов у зараженных мышей с 31% до 0% | |
Рецептор глюкокортикоидов типа II | 3'-НТ | Понижение уровня мРНК в мозге на 50–70%; уменьшение содержания рецептора | |
b-Цепь иммуноглобулина А | 5'-НТ и инициирую-щий кодон | Понижение уровня мРНК на ³50%; задержка созревания В-клеток | |
Фактор роста нервов | Экзоны | Изменение базального уровня фактора роста нервов в коже | |
wnt-1 | Экзоны | Понижение уровня мРНК на £98% | |
Gai2 | 5'-НТ и инициирую-щий кодон | Понижение уровня белка в печени и жировой ткани на £95%, уменьшение скорости роста тела |
Таблица II.3 (окончание)
Гены-мишени | Длина micРНК (п.о.) | Мишень в гене | Фенотип |
Белок нуклеокапсида вируса гепатита мышей | Экзоны | Повышение устойчивости к вирусной инфекции | |
GLUT-2 | » | Понижение уровня белка GLUT-2 на 80% | |
Интерлейкин 3 | » | Понижение уровня IL-3, приводящее к развитию лимфопролиферативных заболеваний b-клеток | |
Миниген COLIA1 | ~1200 | » | Понижение уровня белка COLIA1 на 50%, приводящее к летальной ломкости костей |
Ангиотензиноген | » | До индукции промотора – повышение уровня мРНК в печени; после индукции – понижение уровней мРНК в печени и почках и повышение в мозге на 20 дней, после чего уровни нормализуются; понижение уровня ангиотензиногена в плазме через 30 дней после индукции | |
Глюкокиназа b-клеток | » | Понижение уровня мРНК в b-клетках, сопровождаемое 50%-ным снижением активности глюкокиназы, повышение уровня глюкозы в крови |
Использование антисмысловых РНК для исследования онтогенеза животных выявило высокую чувствительность определенных его стадий к изменению уровня экспрессии генов, а также неспецифическую токсичность антисмысловых транскриптов, проявляющуюся за счет взаимного влияния различных частей ранних эмбрионов друг на друга и гетерогенности экспрессии самих антисмысловых РНК в развивающихся зародышах. Это затрудняет интерпретацию результатов, полученных при экспрессии антисмысловых РНК в раннем эмбриогенезе. Поэтому более удобными объектами для получения фенокопий являются культивируемые соматические клетки животных и растений.
|
Исследование клеточного цикла. Антисмысловые РНК оказались полезными в исследованиях роли протоонкогенов и факторов роста в пролиферации клеток. С использованием такого подхода были изучены протоонкогены c-fos, c-myc, c-src, антионкоген p53. В норме уровень экспрессии c-myc выше в пролиферирующих клетках, чем в дифференцирующихся. В присутствии антисмысловых олигонуклеотидов наблюдали понижение внутриклеточного уровня белка c-Myc в клетках линии HL60, что сопровождалось понижением скорости роста клеток и усилением миелоидной дифференцировки. Природные антисмысловые c-myc-РНК были обнаружены среди транскриптов клеток мышей. Антисмысловые c-fos -РНК предотвращали повторное вхождение покоящихся клеток 3Т3 (фаза Go) в клеточный цикл.
Противовирусная терапия. Внутриклеточная экспрессия антисмысловых РНК, направленных против мРНК некоторых ключевых вирусных белков, может эффективно подавлять вирусную инфекцию. Этот результат был впервые получен с клетками E. coli, содержащими плазмиды, которые экспрессировали антисмысловые РНК, комплементарные различным участкам генов бактериофага SP. Бактериальные клетки приобретали иммунитет к фагу в наибольшей степени в том случае, если антисмысловые РНК были комплементарны 5’-концевым последовательностям мРНК (включая последовательности Шайна–Дальгарно) гена белка созревания. Менее эффективными оказались антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белков оболочки бактериофага или его репликазы. 15-Нуклеотидная антисмысловая последовательность, комплементарная сайту связывания рибосом мРНК, на 94% подавляла выход фага SP и оказывала значительный ингибирующий эффект на развитие родственных фагов Qb и GA. Эти опыты показали принципиальную возможность использования антисмысловых РНК для борьбы с вирусными инфекциями. Кроме того, высокая специфичность антисмысловых РНК по отношению к вирусным последовательностям нуклеотидов сводит к минимуму возможные цитотоксические и другие побочные действия. Современные методы генной инженерии позволяют вводить гены антисмысловых РНК в клетки зародышевой линии животных и растений, что может обеспечивать наследование этих генов в ряду поколений.
|
Обнадеживающие результаты были получены в опытах по ингибированию развития вируса саркомы Рауса (ВСР) в клетках перепелов. Антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белка оболочки ВСР, на 70–80% предотвращали внутриклеточное развитие ВСР, дефектного по белку оболочки, в присутствии плазмиды, экспрессирующей этот белок, которая без антисмысловой РНК комплементировала развитие дефектного вируса.
|
Были получены трансгенные растения табака, которые содержали экспрессирующий вектор, направляющий синтез антисмысловой РНК, комплементарной мРНК белка оболочки вируса мозаики огурцов (ВМО). Такие растения оказались устойчивыми к ВМО только при низкой множественности инфекции, а иммунитет к ВМО мог быть преодолен с помощью высоких концентраций инокулируемого вируса. Аналогичные результаты были получены с трансгенными растениями табака, экспрессирующими антисмысловые РНК, комплементарные транскрипту гена белка оболочки X. В этих опытах уровень экспрессии антисмысловых РНК оказался недостаточным для того, чтобы обеспечить полную устойчивость растений к вирусной инфекции, что требует дальнейшей оптимизации условий экспрессии генов антисмысловых РНК в клетках растений.