Для первоначального появления рибозимов необходим абиотический синтез олигорибонуклеотидов длиной 30–70 оснований. Долгое время это требование было камнем преткновения в разработке теории происхождения жизни, основанной на РНК. Недавно было показано, что после спонтанной иммобилизации на твердой поверхности коротких олигонуклеотидов в присутствии свежих порций активированных мономеров их длина может самопроизвольно удлиняться до 55 остатков. Значительным осложнением для обоснования теории было также то, что мономеры в спонтанно образующихся олигонуклеотидах соединены друг с другом смешанными 2’–5’- и 3’–5’-связями. Такая гетерогенность олигонуклеотидов должна затруднять их последующую матричную активность. Оказалось, однако, что олигоцитидилаты, содержащие смешанные связи, могут служить матрицами для спонтанной полимеризации мономеров, активированных имидазолом, с образованием олигогуанилатов. Таким образом, вышеупомянутые возражения в настоящее время едва ли существенны для обсуждаемой теории.
Для того чтобы репликация РНК самими молекулами РНК имела место, необходимо одновременное присутствие в одном микрообъеме, по крайней мере, двух молекул рибозима-репликазы или же репликазы и комплементарной ей цепи РНК, которая служила бы матрицей для репликазы. В таком случае цикл воспроизводства молекулы репликазы можно представить следующим образом. После разделения цепей синтезированной репликазы и матрицы с последней соединяется олигонуклеотидный праймер, который последовательно удлиняется рибозимом-репликазой, образовавшейся в результате фолдинга второй цепи. Предполагается, что неорганические поверхности, обладающие большим сродством к одноцепочечным РНК, способствуют разделению цепей после завершения акта репликации. При этом должна существовать определенная компартментализация таких молекул (например обеспечиваемая силами адсорбции), препятствующая слишком далекому расхождению разделившихся цепей РНК. И, наконец, синтез РНК, осуществляемый древней репликазой, должен характеризоваться определенным уровнем точности.
|
|
Выше уже были рассмотрены механизмы реакций аутосплайсинга и транс- сплайсинга, осуществляемые рибозимами интронов группы I Tetrahymena. В основе этих процессов лежит основанная на переэтерификации аутокаталитическая реакция объединения (лигирования) двух полирибонуклеотидных последовательностей (экзонов), сопровождающаяся удлинением акцепторной последовательности, которое можно рассматривать как прототип реакции полимеризации. В настоящее время экспериментально подтверждена возможность участия в таких реакциях более коротких олигонуклеотидов. В частности, благодаря этим реакциям пентамеры цитидиловой кислоты (С5) превращались в гетерогенную популяцию олиго(С), содержащую даже 30-членные олигонуклеотиды. Вскоре было показано, что и динуклеотиды GpC могут выступать в качестве доноров мононуклеотидов при элонгации С5 с образованием С10 в реакции удлинения праймера (C5 + 5GpC ® C10 + 5G). Частота ошибок в такой реакции в условиях насыщения GpC-субстратами составляла ~35% и была слишком большой для того чтобы обеспечивать саморепликацию молекул РНК.
Альтернативой реакции удлинения праймера на один нуклеотид за цикл может быть зависимая от матрицы реакция элонгации праймера олигонуклеотидами, которая также была продемонстрирована экспериментально. Здесь донорами выступали триплеты олигорибонуклеотидов и, как уже упоминалось выше, крайним известным случаем такой реакции является объединение экзонов. При этом рибозимы Tetrahymena в качестве матриц для сборки олигонуклеотидов могут использовать различные внутренние последовательности нуклеотидов. Так, олигонуклеотиды длиной 8–12 остатков недавно были применены для сборки полной цепи, комплементарной последовательности самого рибозима.
|
|
Низкий выход продуктов полной длины в экспериментах, упомянутых выше, позволял предполагать, что с этой задачей успешнее могли бы справиться более короткие и активные рибозимы, которые пока еще в природе неизвестны. В связи с этим была разработана система отбора in vitro, позволившая повысить эффективность реакции лигирования путем получения более коротких производных известного рибозима sunY. Приблизительно 2×1013 вариантов нуклеотидных последовательностей рибозима в виде единого пула были подвергнуты нескольким циклам все более строгого отбора вариантов рибозима на повышенную способность к лигированию с последующей амплификацией последовательностей в конце каждого цикла отбора. Такие варианты рибозимов с более короткой полинуклеотидной цепью вскоре были получены. Они обладали способностью эффективно осуществлять из 18 олигонуклеотидов полную сборку цепи РНК, комплементарной своей собственной полинуклеотидной цепи. Наиболее интересной находкой в ходе такого рода экспериментов по отбору из пула случайных последовательностей оказался рибозим длиной в 100 нуклеотидов, получивший название лигазы класса I. Этот рибозим осуществлял образование 3’–5’-фосфодиэфирных связей, и его эффективность была сопоставима с таковой фермента – природной ДНК-лигазы (kкат >1 с-1). Недавно было продемонстрировано, что лигаза класса I может выполнять функции РНК-полимеразы, осуществляя элонгацию праймера путем использования рибонуклеозидтрифосфатов в качестве субстратов. Основным ограничением этой реакции является то, что поскольку комплекс рибозим–матрица удерживается комплементарными взаимодействиями, элонгация праймера прекращается, как только 3’-конец образующегося продукта достигает конца матрицы. В реакции не только используются все четыре рибонуклеозидтрифосфата, но и достигается большая точность синтеза РНК (92%). Дальнейшее ее повышение хотя бы в 10 раз позволило бы этой искусственной РНК-полимеразе воспроизводить свою собственную последовательность нуклеотидов. Полагают, что полное превращение рибозима в РНК-полимеразу произойдет после того, как матрица будет связываться с ним некомплементарными взаимодействиями.
|
|
Условия отбора, использованные для получения эволюционирующих in vitro молекул лигазы класса I, были отработаны на современных субстратах (рибонуклеозидтрифосфатах). Не исключено, что изменение этих условий позволит получить рибозимы с новыми активностями. Недавно был описан рибозим, осуществляющий реакцию, аналогичную кэпированию акцепторного олигонуклеотида, которая завершалась присоединением к его 5’-концу молекулы аденозинмонофосфата посредством 5’–5’-фосфодиэфирной связи. Полагают, что, используя в качестве субстратов высокоактивированные рибонуклеозидмонофосфаты, можно будет получить рибозимы, непосредственно полимеризующие мононуклеотиды.