Вскоре после открытия рибозимов в литературе стала активно обсуждаться гипотеза о каталитической (а не только структурной) функции рРНК в рибосомах. Первые экспериментальные данные в пользу возможной каталитической функции рРНК были получены с ингибиторами биосинтеза белка. Оказалось, что устойчивость к некоторым из них вызывается мутациями в генах рРНК, но не рибосомных белков. Х.Ф. Ноллером и соавторами (1992 г.) было установлено, что удаление из рибосомы большого числа рибосомных белков не инактивирует ее пептидилтрансферазную функцию. Подобного рода данные указывают на то, что именно 23S рРНК является пептидилтрансферазой, однако окончательный вывод мешают сделать оставшиеся рибосомные белки, присутствие которых необходимо для проявления пептидилтрансферазной активности такой ослабленной в структурном отношении рибосомы.
Функциональная связь между рРНК и интронами группы I недавно открылась с неожиданной стороны, когда установили, что аминогликозидные антибиотики, блокирующие биосинтез белка, ингибируют и аутосплайсинг интронов группы I. Это открытие нашло дальнейшее развитие в связи с обнаружением у интронов группы I слабой аминоацилэстеразной активности. Было сделано предположение, что интроны группы I и рибосомная РНК могут обладать общими структурными (и функциональными) доменами. Кроме того, мутантные рибозимы, полученные путем отбора in vitro по критерию ускоренного переноса фосфодиэфирных связей, оказались способными, хотя и в слабой степени, расщеплять амидные связи. На основании такого рода данных Ноллер и соавторы сделали предположение о том, что первые примитивные рибосомы образовались из молекул РНК, родственных интронам группы I, которые были в состоянии осуществлять перенос ацильных групп, необходимый для образования пептидных связей. Таким образом, все эти данные в совокупности позволяли предполагать, что функция рРНК в биосинтезе белка является каталитической, а некоторые РНК сегодняшнего дня, имеющие отношение к обсуждаемым процессам – это "молекулярные ископаемые".
|
|
При наличии активированных аминокислот синтез пептидов не представляется трудной задачей. Активированные аминокислоты конденсируются даже в водных растворах с образованием коротких пептидов, а цепи длиной до 50 аминокислот образуются на минеральных поверхностях. Абстрактная схема биосинтеза белка в примитивных системах с участием каталитических РНК представлялась следующим образом. Примитивные РНК, аминоацилирующие сами себя активированными аминокислотами по аутокаталитическому механизму, могут выступать донорами и акцепторами аминокислот в реакциях переноса ацильных групп, катализируемых рибозимами. Для признания РНК в качестве молекул, осуществлявших в примитивных системах синтез белков, необходимо показать возможность выполнения ими следующих функций: узнавание аминокислот, аминоацилирование тРНК, перенос ацильных групп, активация аминокислот и синтез пептидов. Рассмотрим реальность каждого из этих предположений.
Молекулы РНК могут распознавать аминокислоты. По крайней мере, у двух природных РНК (как и у обсуждавшихся выше искусственных аптамеров) обнаружены структурные элементы, способные связывать аминокислоты. Интроны группы I связывают аргинин в области спирали Р7 (см. рис. I.15, а). Вторым примером является трансактивируемый район (trans -activating region – TAR) ВИЧ, который специфически взаимодействует с белком-трансактиватором tat во время вирусной инфекции. Этот участок ВИЧ-РНК также обладает способностью взаимодействовать с аргинином. Кроме того, известно, что редактирующая функция аминоацил-тРНК-синтетаз (разрушение связи между ошибочно соединенными аминокислотой и тРНК) включает опосредованное РНК распознавание аминокислот. Предполагается, что в процессе редактирования имеют место непосредственные контакты РНК с аминокислотами. Более того, в системах с искусственным отбором РНК из пула молекул со случайными последовательностями удалось получить четыре различных аргининсвязывающих структурных элемента (аптамера) с разным уровнем специфичности. С помощью того же подхода были выделены акцептирующие цитруллин аптамеры, а также другие молекулы РНК, взаимодействующие с более гидрофобными аминокислотами – валином и триптофаном.
|
|
Спонтанное аминоацилирование РНК. Процесс аминоацилирования тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами in vivo происходит в два этапа: вначале фермент активирует соответствующую аминокислоту с образованием 5’-аминоациладенилата, который затем атакуется 2’(3’)-концом тРНК, что сопровождается возникновением соответствующей ковалентной связи между аминокислотой и тРНК. Нагруженные таким образом молекулы тРНК далее используются рибосомами в качестве субстратов при образовании пептидных связей. Недавно тем же методом селекции из пула случайных РНК, представленного 1,7·1014 молекулами, были получены рибозимы, способные при наличии активированных аминокислот спонтанно аминоацилироваться. Пул РНК инкубировали при 0о с химически синтезированным фенилаланил-5’-аденилатом в присутствии ионов Mg2+ и Ca2+. Аминоцилированные РНК обнаруживали по появлению свободной a-аминогруппы фенилаланина. Молекулы РНК, меченные такими гидрофобными группами, очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращенной фазе. После 11 циклов отбора были получены спонтанно аминоацилирующиеся РНК со скоростью, в 105 раз превышающей скорость реакции в контроле. Распознавание аминокислоты рибозимом было слабым, поскольку образование специфических комплексов рибозима с субстратом обнаружить не удалось.
|
|
Перенос ацильных групп, катализируемый РНК. Повсеместное использование аминоациладенилатов и аминоацилированных тРНК при трансляции в природных условиях указывает на возможную роль РНК в ранних системах трансляции. Действительно, способность рибозимов к спонтанному аминоацилированию позволяет предполагать и возможность их участия в следующем этапе биосинтеза белка – переносе аминоацильной группы с донорной молекулы на свою собственную акцепторную, т.е. в осуществлении аминоацилтрансферазных реакций. Такая активность была обнаружена среди 1015 молекул РНК случайной структуры, подвергнутых искусственному отбору на протяжении нескольких циклов. В этой системе отбора в качестве донора аминоацильной группы был использован гексануклеотидный фрагмент РНК, содержащий на 2’(3’)-конце активированный остаток N-биотинилированного метионина. С помощью стрептавидин-агарозы отбирали молекулы РНК, способные переносить ацильную группу на свою собственную 5’-гидроксильную группу. Подобные рибозимы, среди которых доминировали однотипные молекулы, были получены после 11 циклов отбора.
Анализ первичной структуры таких рибозимов обнаружил вблизи 3’-концов наличие высококонсервативной внутренней матрицы, которая обладала способностью связывать и приводить в контакт друг с другом 2’(3’)-конец донорной молекулы и акцепторный 5’-конец своей собственной полинуклеотидной цепи. Рибозимы оказались не просто матрицей. Они действительно катализировали перенос ацильных групп, ускоряя этот процесс в 103 раз (kкат = 9,4·10-2 мин-1) по сравнению с системами, в которых была задействована только матрица. Интересно, что два неправильно спаренных основания G–U в месте стыковки дуплексов донор–матрица и акцептор–матрица оказались необходимыми для функционирования рибозимов, стимулируя реакцию переноса ацильной группы в 10 раз.
Образование амидных связей, опосредованное рибозимами. Рибозимы, конструирование которых было описано выше, катализировали реакцию трансэтерификации карбоксиэфиров. Для проверки возможности образования этими рибозимами амидных связей их 5’-концевые гидроксильные группы заменяли на аминогруппы. Оказалось, что такие рибозимы с высокой эффективностью осуществляют перенос биотинилированного метионина с 2’(3’)-конца гексануклеотида-субстрата на свою собственную 5’-концевую аминогруппу. Константа скорости первого порядка реакции образования амидной связи (0,58 мин-1) была лишь в 15 раз ниже таковой (8 мин-1), осуществляемой природной пептидилтрансферазой рибосом с использованием фрагмента аминоацилированной тРНК.
РНК-центрический взгляд на происхождение трансляции и самой жизни. Получение аптамеров, способных специфически распознавать аминокислоты, и рибозимов, аминоацилирующих самих себя, явилось серьезным аргументом в пользу ключевой роли РНК в происхождении трансляции. Если предположить, что РНК могут мобилизовать энергию макроэргических связей ATP, то в скором времени будут обнаружены и рибозимы, активирующие аминокислоты путем синтеза соответствующих аминоациладенилатов. Следуя тем же аргументам, можно надеяться на скорое получение рибозимов, способных синтезировать пептиды. Если все основные стадии синтеза белка будут осуществляться рибозимами, то, по мнению А. Хагер и соавторов (1996 г.), можно предположить следующие этапы эволюционирования системы трансляции. Вначале синтез пептидов выполняется рибозимами, не обладающими высокой специфичностью по отношению к своим субстратам – донорам и акцепторам аминоацильных групп. Некоторые пептиды могли начать синтезироваться после приобретения рибозимами специфичности в отношении выбора субстратов. Хотя этот громоздкий механизм для образования каждой пептидной связи в синтезируемом пептиде требует собственного рибозима, однако он не кажется абсурдным, так как до сих пор бактерии используют такой принцип для синтеза некоторых своих пептидов (например молекулы грамицидина) с помощью специфического набора ферментов. Активность рибозимов могла быть повышена с помощью коротких РНК, объединяющих субстраты друг с другом. После эволюционного возникновения таких кофакторных РНК требования к специфичности рибозимов, синтезирующих пептиды, будут снижаться, и в конце концов появится истинная пептидилтрансфераза в виде 23S рРНК. Как известно, рРНК функционирует в тесной связи с матрицей мРНК, которая специфически сближает донорные и акцепторные аминоацил-тРНК.
Все рассмотренные аргументы подчеркивают важную, если не исключительную, роль РНК в происхождении жизни на Земле. Большинство современных ферментов являются белками, а все известные рибозимы действуют на РНК-субстраты. Уже одно это показывает, что цепь событий, приведшая к такому повороту развития эволюционных преобразований живых систем, остается до конца не понятой. Лабораторные методы, позволяющие моделировать эволюционирование рибозимов in vitro, дают возможность продолжить экспериментальное исследование глобального вопроса о происхождении жизни.