Помимо самой достаточно сложной технологии производства микроматриц, к числу факторов, ограничивающих их широкое применение, относятся кинетические параметры гибридизации, а также точность и чувствительность обнаружения в гибридах ошибочно спаренных нуклеотидов.
Кинетика гибридизации. Гибридизация в гетерогенных смесях нуклеиновых кислот происходит медленно. При использовании олигонуклеотидов в качестве зондов для ее завершения обычно требуется несколько часов, тогда как в случае зондов кДНК процесс продолжается в течение 6–24 ч при высокой температуре. Поиск зондом своей иммобилизованной мишени происходит двумя путями. Во-первых, может произойти прямая гибридизация непосредственно из раствора, эффективность которой в первом приближении не зависит от размера зонда. Во-вторых, зонд вначале может неспецифически связаться с поверхностью подложки, диссоциировать из комплекса и, диффундируя вдоль поверхности, достичь мишени. Скорость гибридизации по второму механизму резко возрастает, когда длина зонда становится меньше 1000 нуклеотидов. С учетом этого время, необходимое для гибридизации, может быть уменьшено путем укорачивания молекулы зонда, повышения его концентрации в гибридизационных смесях и сокращения расстояния, которое необходимо преодолеть зонду до мишени путем диффузии.
Поскольку концентрация зондов в гибридизационных смесях ограничена их химическими свойствами, основным фактором, с помощью которого можно уменьшать время гибридизации и объем наносимого образца с зондом, становится плотность расположения пятен ДНК-мишеней (элементов) в микроматрицах. Размеры индивидуальных элементов микроматриц, получаемых современными фотолитографическими методами, лежат в пределах 5–10 мкм при общей их максимальной плотности на подложке ~106/см2. Плотность элементов в обычно используемых микрочипах, полученных с помощью фотолитографии, составляет 104–105/см2. При использовании микророботов для нанесения кДНК на поверхность подложки плотность расположения элементов достигает лишь ~103/см2. И в том, и в другом случае зондам для гибридизации необходимо диффундировать к мишени, находящейся в индивидуальном элементе микроматрицы, общие размеры которой как правило составляют 1 х 1 см. Поскольку время диффузии зонда пропорционально квадрату расстояния до мишени, общее время гибридизации можно понизить путем увеличения плотности расположения элементов на микрочипе. Кроме того, одним из подходов к уменьшению времени гибридизации является придание молекулам зондов направленности перемещения к мишеням в электрическом поле, когда микроматрицу располагают на электроде.
|
|
Чувствительность метода. Чувствительность метода специфического обнаружения последовательностей ДНК с использованием технологии микроматриц определяется отношением количества зонда, связавшегося со специфической мишенью, к количеству неспецифически связавшегося зонда. Чем выше это отношение, тем больше чувствительность метода. Неспецифическое связывание зонда может происходить как с самой подложкой, так и с гомологичными зонду последовательностями нуклеотидов ДНК-мишени с образованием неправильно спаренных оснований. В последнем случае могут быть получены ложноположительные результаты. Поскольку площадь пятна специфической мишени значительно меньше доступной зонду поверхности микрочипа, при малых временах гибридизации количество неспецифически сорбированного зонда будет значительно превышать количество зонда, находящегося в правильных гибридах. Эту ситуацию улучшают путем увеличения времени гибридизации до достижения процессом стационарной фазы. В этой связи интерпретация картин гибридизации требует постановки адекватных контролей для оценки эффективности неспецифического связывания зонда поверхностью микрочипа. Кроме того, для количественной оценки гибридизации необходимо использовать количества зонда, не насыщающие мишени микрочипа во время отжига.
|
|
Эффективность детекции флуоресценции как таковой является одним из самых сильных факторов, сдерживающих развитие технологии микрочипов ДНК. По мере уменьшения размеров элементов микроматриц все меньшее количество молекул ДНК-мишени становится доступным зонду. Современные методы позволяют обнаруживать ДНК-мишени в аттомолярных концентрациях (10-18 М) при плотности в одну молекулу ДНК на 1 мкм2. Для этой цели чаще всего используются системы, основанные на конфокальной сканирующей лазерной микроскопии. При определении альтернативных состояний гомологичных последовательностей ДНК-мишеней, в частности, аллельного (нормального или мутантного) состояния конкретного гена, применяют двухцветные системы. В таких системах один из зондов, например специфичный в отношении аллеля дикого типа, метят флуоресцентным красителем одного цвета (красным), а другой (мутантный) – флуорофором другого цвета (зеленым). Зонды одновременно гибридизуют с анализируемым микрочипом, который далее сканируется при обеих длинах волн, что позволяет обнаруживать тот или иной зонд, сохранившийся в гибриде, и на этом основании делать вывод об аллельном состоянии гена.