Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии




Несмотря на впечатляющие успехи генотерапии на модельных животных, в настоящее время имеется ряд принципиальных затруднений, препятствующих широкому использованию метода для лечения заболеваний человека. При проведении генотерапии необходимо выполнять, по крайней мере, следующие условия. Каждый ген, интегрированный в геном человека, должен нормально экспрессироваться и в случае необходимости адекватно отвечать на регуляторные сигналы организма. Интеграция гена в геном не должна сопровождаться инсерционным мутагенезом, нарушающим функционирование жизненно важных генов, и вообще оказывать неблагоприятное генетическое действие. При этом дефектный ген не должен оказывать отрицательного влияния на функционирование трансгена. Необходимо помнить, что частота интеграции вводимого гена в геном эмбриональных клеток сильно варьирует от клетки к клетке, хотя и несколько возрастает при использовании ДНК в линейной форме, а также при увеличении числа копий генов, вводимых в пронуклеус. Интеграция гена часто сопровождается точковыми мутациями, делециями, дупликациями и перестройками ДНК. Кроме того, интеграция генов в геном, как правило, носит случайный характер, что затрудняет введение гена в требуемый участок генома и может сопровождаться инсерционным мутагенезом. Следствием инсерционного мутагенеза может быть инактивация жизненно важных генов или же превращение протоонкогенов в онкогены.

Ни одна из вышеперечисленных технических проблем, возникающих при практическом использовании генотерапии, не является неразрешимой, однако преодоление этих трудностей требует времени. Реализация международного проекта "Геном человека" даст возможность исследователям использовать на практике от 80 000 до 100 000 генов человека, в том числе и для генотерапии. Все это создает реальные перспективы преодоления многих заболеваний человека, считающихся неизлечимыми.

Глава 11. ДНК-ДИАГНОСТИКА И ДНК-ТИПИРОВАНИЕ

Рис. II.30. Генетические последствия мутаций, происходящих в геноме соматических клеток человека на разных стадиях эмбриогенеза

Черным цветом закрашены места локализации клонов мутантных клеток разных размеров в организме человека

 

Исследования показывают, что большинство заболеваний человека, а возможно, и все его болезни связаны с мутациями, приводящими к изменению уровней экспрессии конкретных генов. Мутации в определенных генах нарушают функционирование биохимических систем, что в конце концов приводит к развитию соответствующих патологических состояний организма (рис. II.30). В том случае, если мутации происходят в геноме клеток зародышевой линии человека, все соматические клетки организма-потомка, который развивается из мутантной зиготы, образовавшейся от слияния мутантных гамет в процессе оплодотворения, будут содержать указанную мутацию. Чем позже в онтогенезе человека возникает соматическая мутация, тем меньше размер клона мутантных клеток во взрослом организме. Если же мутация доминантна, т.е. патологический мутантный признак, определяемый мутантным геном, проявляется даже при наличии в соматических клетках копии нормального гена, полученного от другого родителя, то возникает наследственное заболевание.

В случаях, когда мутация, определяющая мутантный фенотип, рецессивна (ее действие проявляется лишь в гомозиготном состоянии, при котором один и тот же мутантный ген получен от каждого из родителей), можно говорить о предрасположенности организма-гетерозиготы к соответствующему заболеванию и носительстве мутантного гена. Действительно, организм, у которого действие рецессивной мутации маскируется функционированием другого, полноценного аллеля, внешне (фенотипически) выглядит нормальным. Однако у такого организма гораздо больше шансов дать больное потомство в браке с носителем такого же мутантного гена, что является одной из причин запрета на близкородственные браки. С другой стороны, у носителей мутантных генов в гетерозиготном состоянии может произойти соматическая мутация в соответствующем аллельном гене соматических клеток, что также станет причиной развития приобретенного генетического заболевания. В качестве одного из примеров такого заболевания мы уже рассматривали ранее ретинобластому – онкологическое заболевание, поражающее сетчатку глаз, чаще всего, в детском возрасте. Это заболевание развивается в два этапа: вначале организм ребенка получает от одного из родителей мутантный ген RB1, являющийся рецессивным онкогеном (антионкогеном), а затем в онтогенезе в одной из соматических клеток в результате мутации происходит инактивация второй его копии, что вызывает малигнизацию клетки и развитие опухоли. Такой же механизм лежит в основе возникновения некоторых форм диабета, а также ряда онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Традиционная диагностика наследственных и инфекционных заболеваний строится на детальном изучении симптомов и проведении многочисленных биохимических анализов, включая культивирование патогенных микроорганизмов на сложных питательных средах. При этом выявление бессимптомного носительства вредных аллелей и микроорганизмов-возбудителей превращается в чрезвычайно трудоемкую задачу. В частности, традиционными цитогенетическими методами можно выявить в геноме человека лишь некоторые крупные хромосомные перестройки: протяженные делеции и транслокации генетического материала, потерю или приобретение целых хромосом. При этом мелкие делеции, транслокации и вставки, а также точковые мутации, которые являются наиболее часто встречающимися изменениями генетического материала, остаются не обнаруженными. То же имеет место и при диагностике бессимптомного носительства возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, например вируса иммунодефицита человека, которые в латентной стадии инфекции могут присутствовать в организме человека лишь в небольшом числе копий.

Разработанные недавно новые методы молекулярной биологии, и особенно метод ПЦР, значительно облегчили проведение диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. При этом мутации выявляются в ДНК клинических образцов, а бессимптомное присутствие возбудителей обнаруживают по наличию геномных ДНК или РНК соответствующих вирусов или бактерий.

В основе всех методов ДНК-диагностики лежат три фундаментальных принципа молекулярной биологии (рис. II.31). Это прежде всего существование комплементарных взаимодействий между двухцепочечными молекулами нуклеиновых кислот (первый принцип), которые после денатурации с последующей ренатурацией (второй принцип) позволяют им безошибочно находить друг друга и восстанавливать первоначальную вторичную структуру. Если же в процессе ренатурации нуклеиновых кислот добавить в пробы короткие олигонуклеотиды (зонды или праймеры), ковалентно соединенные с каким-либо меченым соединением, то они благодаря комплементарным взаимодействиям соединяются с тем участком нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую последовательности нуклеотидов зонда или праймера (третий принцип). Следовательно, наличие связавшейся с нуклеиновой кислотой метки с высокой точностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.

Рис. II.31. Три молекулярно-генетических принципа, лежащих в основе ДНК-диагностики

Звездочками отмечено наличие радиоактивной, флуоресцентной или другой метки в олигонуклеотидных зондах или праймерах на одном из их концов

 

Современные методы ДНК-диагностики находят широкое применение в медицине для обнаружения мутаций при наследственных (или приобретенных) заболеваниях и ДНК-типирования организмов (рис. II.32). ДНК-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний может заключаться как в обнаружении известных, уже описанных мутаций, так и в поиске новых мутаций, приводящих к тому же патологическому состоянию организма. ДНК-типированием называют поиск генотипических особенностей у микро- или макроорганизма, которые позволяют его идентифицировать и(или) отнести к той или иной систематической группе.

Рис. II.32. Применение методов ДНК-диагностики в медицине

 



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2022-11-01 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: