Для того чтобы терапевтическое действие трансгенов реализовывалось в полной мере, часто бывает необходимо обеспечивать их тканеспецифическую экспрессию в клетках-мишенях на протяжении всей жизни индивидуума. Из-за ограниченной емкости современных векторов, используемых для адресной доставки трансгенов, не представляется возможным применение для регуляции экспрессии энхансеров и сайленсеров, которые в норме чаще всего создают условия для тканеспецифического характера экспрессии генов в их обычном генетическом окружении (подробнее см. раздел 3.2). Из экспериментов с трансгенными животными известно, что для эффективной экспрессии трансгена часто требуется присутствие его интронов. Более того, чтобы предотвратить возмущающее действие регуляторных элементов хромосом клеток-хозяев, необходимо включать в трансген протяженные фланкирующие последовательности. В частности, для достижения полного уровня экспрессии кластера глобиновых трансгенов требовалось фланкировать кластер некодирующей 5’-концевой последовательностью b-глобинового гена и 3’-концевой последовательностью e-глобинового гена длиной в 20 т.п.о. каждая. Таким образом, для достижения полного уровня экспрессии трансгена необходимо вводить в клетки-мишени фрагменты геномной ДНК длиной в 250 т.п.о. и более, что является трудновыполнимой задачей. Для исключения интерференции эндогенных регуляторных элементов с таковыми трансгенов часто требуется присутствие в генно-инженерных конструкциях специальных регуляторных элементов – инсуляторов (см. раздел 3.2.4), которые должны предотвращать действие гетерологичных энхансеров на трансгены. При этом необходимо иметь в виду, что инсуляторы не оказывают защитного действия на экспрессию трансгенов, не интегрированных в хромосому клетки-реципиента. Таково в самых общих чертах генетическое окружение трансгена, действие которого необходимо учитывать при создании соответствующих генно-инженерных конструкций. Однако имеются и другие, лучше изученные механизмы, которые обеспечивают тканеспецифическую экспрессию трансгенов.
|
|
Тканеспецифические промоторы. Обеспечение тканеспецифической экспрессии трансгена может достигаться путем использования в генно-инженерных конструкциях тканеспецифических промоторов, которые содержат регуляторные элементы, обеспечивающие избирательную транскрипцию гена в определенных тканях. В связи с этим повышенный интерес вызывают промоторы гена регулятора трансмембранной проводимости кистозного фиброза (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – CFTR) и различных генов, специфически экспрессирующихся в мышечных тканях. Установлено, что фрагмент ДНК длиной в 2 т.п.о., фланкирующий ген CFTR с 5’-конца, обеспечивает, хотя и на низком уровне, экспрессию трансгенов в клетках дыхательных путей человека и мышей как in vitro, так и in vivo. Аналогичного эффекта удалось достичь с использованием промотора гена a-актина скелетных мышц и энхансера гена легкой цепи миозина в составе ретровирусных векторов. Эксперименты такого рода приближают то время, когда экспрессия трансгенов в процессе генотерапии будет строго управляемой и тканеспецифической, что является необходимым условием использования генотерапии для лечения заболеваний человека.
|
|
Промоторы, активируемые в клетках опухолей. Описано несколько случаев, когда клетки опухолевых тканей обеспечивают более высокий уровень экспрессии определенных генов по сравнению с соответствующими клетками здоровых тканей, что достигается повышением уровня активности их промоторов. Это явилось основанием для разработки одной из стратегий генотерапии рака. Например, многие меланомы характеризуются высоким уровнем синтеза меланина, что связано с активацией промоторов гена тирозиназы и генов, ассоциированных с тирозиназой белковTRP-1 и TRP-2. Эти промоторы, специфически активирующиеся в раковых клетках, были использованы для обеспечения тканеспецифической экспрессии гена-активатора предшественников цитостатиков. Другим примером является раковый эмбриональный антиген (carcinoembryonic antigen – CEA) – специфический маркер опухолевых клеток, локализованный на их поверхности. Экспрессия этого белка регулируется на уровне транскрипции. Регуляторные последовательности его гена также были использованы для избирательной активации предшественников цитостатиков в раковых клетках через активацию соответствующего гена. Аналогичные результаты были получены и с использованием регуляторных элементов онкогенов, усиленно экспрессирующихся в опухолевых тканях. Подробнее о терапевтическом использовании этого подхода см. ниже.
Направленная интеграция трансгенов в определенные генетические локусы. Альтернативным, хотя и более трудоемким, подходом к достижению избирательной экспрессии трансгенов является их введение сразу под контроль эндогенных регуляторных элементов клеток-мишеней, которые присутствуют в сайте интеграции. Известно, что адено- ассоциированный вирус дикого типа осуществляет сайт-специфическую интеграцию своего генома в хромосому 19 человека и что такая специфичность сохраняется и в ряде генно-инженерных конструкций, полученных с его использованием. Однако векторы на основе ДНК адено-ассоциированных вирусов не могут нести вставку, размер которой превышает 2,5 т.п.о., что ограничивает их практическое использование.