Несмотря на разработку множества новых лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний, за последние 30 лет не удалось увеличить число пациентов, проживших более 5 лет после начала заболевания распространенными видами рака, например раком молочной железы или кишечника. Этот факт, выявивший принципиальную неэффективность химиотерапии, стимулировал разработку альтернативных методов лечения онкологических заболеваний, среди которых одним из самых многообещающих подходов является генотерапия.
Многие формы онкологических заболеваний протекают на фоне нарушения регулируемой экспрессии онкогенов или антионкогенов. Причиной такого расстройства на молекулярном уровне чаще всего являются соматические мутации. В связи с этим одним из основных подходов к генотерапии рака является доставка в опухолевые ткани соответствующих неповрежденных генов, что классифицируется как прямая генотерапия, т.е. исправление структуры гена. В случае нарушений экспрессии генов-супрессоров доставляемые трансгены должны кодировать и экспрессировать соответствующие функционально активные белки. В отличие от этого для подавления экспрессии аномально активных онкогенов чаще всего используют антисмысловые РНК или рибозимы.
Другую группу экспериментов, направленных на генотерапию рака, которые исторически были осуществлены раньше прямой генотерапии, можно было бы назвать косвенным воздействием на гены опухолевого роста. При таком подходе в результате направленной доставки трансгенов в опухолевые ткани последние становятся более чувствительными к конкретным экзогенным воздействиям. Это может достигаться путем доставки гетерологичных генов антигенов главного комплекса гистосовместимости, экспрессия которых делает соответствующие клетки иммуногенными, стимулирующими противоопухолевый иммунитет больного организма. Тот же результат получают при экспрессии в опухолевых клетках генов некоторых цитокинов, фактора некроза опухолей, a- или g-интерферона.
|
|
Векторы, переносящие трансгены HLA-B7 и/или IL-2, уже прошли многочисленные клинические испытания. Ранее на лабораторных животных было показано, что экспрессия на поверхности опухолевых клеток рекомбинантных аллоантигенов главного комплекса гистосовместимости приводит к активации иммунной системы животных против опухолевых клеток и регрессии опухолей. В новейших исследованиях рекомбинантные ДНК были успешно применены для лечения меланом. В использованном подходе рекомбинантный ген, кодирующий аллоантиген главного комплекса гистосовместимости человека HLA-B7, непосредственно вводили в опухоли HLA-B7-негативных пациентов в составе ДНК-липосомных комплексов. Обнадеживающие результаты получены и при клиническом применении этого подхода для лечения пяти больных с меланомами на IV стадии. У одного пациента произошла полная регрессия опухоли после двух инъекций рекомбинантной ДНК, у других наблюдали существенное улучшение состояния. Плазмидную ДНК обнаруживали в опухолях (но не в сыворотке крови) на 3–7-й день после начала лечения, а рекомбинантный белок HLA-B7 присутствовал в биоптатах опухолей у всех пациентов. Это свидетельствовало об эффективной экспрессии рекомбинантных генов в клетках меланомы и непосредственном вкладе белка HLA-B7 в терапевтический эффект генотерапии.
|
|
Другим косвенным методом является изменение клеток, таких как лимфоциты, инфильтрующие опухоли (TIL), уничтожающих раковые клетки, путем введения в них трансгенов, кодирующих цитотоксические белковые факторы или гены цитокинов для повышения противоопухолевой активности этих клеток иммунной системы. Для осуществления контроля над количеством остающихся живыми раковых клеток после терапевтических воздействий на них ex vivo клетки костного мозга маркируют, как правило, геном устойчивости к неомицину.
Ниже будут рассмотрены еще несколько примеров использования генотерапевтических воздействий для лечения онкологических заболеваний человека. Большинство описанных подходов оказались эффективными на экспериментальных животных и прошли клинические испытания.
Замещение дефектных генов-супрессоров опухолей. Мутации в антионкогене р53 обнаруживают в 50% солидных опухолей у человека. Продукт гена р53 выполняет функции активатора транскрипции других генов, ингибирующих переход нормальных клеток от фазы G1 к S-фазе клеточного цикла. Внутриклеточный уровень этого белка возрастает в ответ на повреждение геномной ДНК, что сопровождается задержкой клеток в фазе G1 и репарацией повреждений, а также терминальной дифференцировкой или же, если повреждения ДНК оказываются слишком большими, – апоптозом – генетически запрограммированным самоубийством клеток. Инактивация белка р53 ассоциируется с неконтролируемым ростом опухолевых клеток многих типов. Было установлено, что введение функционально активного трансгена р53 в клетки с поврежденным геном белка р53 подавляет рост опухолевых клеток или индуцирует в них апоптоз.
|
|
Подавление экспрессии онкогенов. В первой части книги уже упоминалось о том, что гены семейства ras представляют собой группу протоонкогенов, наиболее часто активирующихся при опухолевом перерождении клеток. В частности, более чем у 30% клеток аденокарцином легкого и у 80% клеток опухолей поджелудочной железы обнаруживается мутация в онкогене ras, что ассоциируется с плохим прогнозом протекания заболевания. Введение в опухолевые клетки трансгенов, экспрессирующих антисмысловую ras -РНК, приводит к уменьшению уровня пролиферации клеток и понижению их опухолеродности. Проходят клинические испытания ретровирусных векторов, экспрессирующих антисмысловые РНК гена ras. Аналогичный эффект может быть достигнут и в результате применения соответствующих рибозимов.
Введение "генов-самоубийц", или сенсибилизирующих генов в опухолевые клетки. В большинстве систем, основанных на этом принципе, используют ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk). Как уже упоминалось выше, такой ген придает клеткам, его экспрессирующим, чувствительность к ганцикловиру (GCV) – лекарству, обычно используемому для лечения герпеса. HSV-tk обладает способностью фосфорилировать GCV с образованием соответствующего монофосфата, который, в свою очередь, фосфорилируется клеточными киназами до GCV-трифосфата. Последний в процессе репликации включается в строящиеся цепи ДНК, вызывая терминацию синтеза ДНК и гибель клеток. Интересным следствием гибели клеток под действием активированного GCV является распространение летального воздействия на соседние клетки. Таким образом, соседние опухолевые клетки, не содержащие трансгена HSV-tk, тем не менее элиминируются. Это явление получило название эффекта летального соседства (neighboring-killing effect), или эффекта свидетеля (bystander effect). Проводятся клинические испытания HSV-tk-трансгена в составе ретровирусных векторов в качестве действующего начала при лечении опухолей мозга или их метастазов. В этих экспериментах мышиные клетки, экспрессирующие трансген, непосредственно имплантировали в растущие опухоли. Поскольку перенос трансгенов, опосредованный ретровирусами, ограничивается пролиферирующими клетками, в результате экспрессии трансгена происходит избирательная гибель именно опухолевых клеток. Использование подхода с трансгеном HSV-tk в клиниках дало обнадеживающие результаты, так как при этом само заболевание протекало легче и лечение хорошо переносилось пациентами. Были сконструированы и аденовирусные векторы, экспрессирующие трансген HSV-tk, которые в настоящее время испытываются для лечения раковых заболеваний.
Введение трансгенов, активирующих лекарства, в опухолевые клетки. Бактериальный ген цитозиндезаминазы является одним из примеров гена-сенсибилизатора. Этот фермент способен превращать нетоксичный для человека 5-фторцитозин в 5-фторурацил – потенциальный цитостатик. Поэтому 5-фторцитозин оказывает летальное действие на клетки, экспрессирующие цитозиндезаминазу, и остается индифферентным по отношению к другим клеткам организма человека. Ген цитозиндезаминазы рассматривается в качестве защитного средства, предохраняющего организм от неконтролируемой пролиферации клеток, измененных в результате генотерапии. Если такая нежелательная пролиферация происходит, клетки уничтожают in vivoс помощью 5-фторцитозина, нетоксичного для других клеток.
Терапия предшественниками цитотоксических лекарств, активируемых продуктами экспрессии трансгенов в клетках-мишенях. При этом подходе пытаются усилить специфичность действия цитостатиков благодаря различиям в уровнях экспрессии трансгенов в клетках разных опухолей. Для реализации такой идеи ген-сенсибилизатор доставляется в нормальные и опухолевые клетки с помощью ретровирусного вектора. При этом ген находится под контролем промотора, обеспечивающего его преимущественную экспрессию в опухолевых клетках, так как именно в них присутствуют необходимые для активации транскрипции белковые факторы. Если ген-сенсибилизатор кодирует цитозиндезаминазу, то 5-фторцитозин будет активироваться только в присутствии этого фермента, синтезирующегося в опухолевых клетках (см. выше). Конструкции с регуляторным доменом гена CEA используют для лечения метастазов колоректального рака. Другим примером является рекомбинантный вектор, обладающий промотором онкогена c-erbB-2, разработанный для лечения рака молочной и поджелудочной желез. Именно в этих опухолях часто наблюдают сверхэкспрессию такого гена.
Защита стволовых клеток от токсического действия лекарств во время химиотерапии. Ретровирусный вектор, экспрессирующий ген множественной лекарственной устойчивости MDR1, был использован при раке яичника с целью придания устойчивости стволовым клеткам организма к цитостатикам, используемым для лечения этого заболевания. Экспрессия данного гена делает клетки нечувствительными к таксолу, даунорубицину и многим другим цитостатикам и позволяет сохранять их жизнеспособность и пролиферативный потенциал, необходимые для восстановления жизнеспособности организма после применения интенсивной химиотерапии.