Были исследованы различные физико-химические параметры, такие как общая зола, водорастворимая зола, растворимая в кислоте зола, сульфатная зола, содержание влаги(потеря при сушке), содержание воды. Также изучены чужеродные органические вещества, экстрационные ценности (пеьролейный эфир хлороформ, спирт и вода). В дополнении к их суммарному количеству аэробных бактерий, были проведены исследование на наличие патогенных микроорганизмов (Escherchia coli, Salmonella species, Staphylococcus aurus) согласно официальному методу, предписанному в индийской фармакопее, 1996 и по методу ВОЗ в определеии качества материалов растений(ВОЗ/QCMMPM,1992).
Предварительный фитохимический анализ.
Для предварительного фитозимического анализа взяли 100 грамм корня порошкообразного вида и экстрагировали с гексаном, хлоформом и этанолом с помощью аппарата сокслета. Водный экстракт получали путём холодной мацерации. Экстракт концетрироваои в вакууме с использованием моторного вакуумного испарителя, затем высушили и взвесили. Каждый экстракт протестировали на наличие разных фитоконсестенций, а именно: тритерпеноиды, стероиды, алкалоиды, сахара, танины, гликозиды, флаваноиды, белки и аминокислоты.
Хромотографические исследования.
Были проведены тонкослойная хромотография(TL) и высокоэффективная тонкослойная хроматография (HPTLC) спиртового экстракта Костуса Прекрасного.
Подготовка и применение испытуемого образца.
Примерно 100 мг эианольго экстракта растворили в этаноле и с размером в пятнышко (не больше 4 мм) были расположены на стартовой линии, на предварительно активизированных пластинках ТСХ через капилляры. Стартовые линии были параллельны и выше края на 15 мм. Расстояние было отмечено на живой фазе, оно составило 10-15 мм в длину и не больше 5 мм в ширину.
Система растворов.
Сначала ТСХ был проведён в чистых растворителях на основе пробного т.е. провального метода. Затем были применены различные комбинации растворителей для лучшего разделения компонентов. Путём оптимизации растворителей толуин: этиловый ацитат: GAA: муравьиная кислота (2:1:1:0,75) была найдена лучшая система для определения составляющих и взята за основу HPTLC исследований.
Разработка хроматограммы.
Пятнами дали высохнуть, а затем пластинки размещали вертикально так, чтобы точки прикладывания находились выше поверхности живой фазы. Закрыли камеру и довели хромотограмму до комнатной температуры, дали растворителю подняться до требуемого уровня. Пластинки извлекли и отметили положение растворителей, затем дали испариться при комнатной температуре.
Наблюдение и интерпретация хроматографии.
За полученными пластинками наблюдали при дневном свете, под коротким и длинноволновым ультрафиолетовым светом. Также пластинки побывали в иодной камере. Там они были опрысканы реагентом анисальдегидной серной кислоты и нагреты в электрической печке в течение 30 минут. Затем были вычислены значения Rf пластинок.
Метод HPTLC в вычислении количества диосгенина в экстракте Костуса Прекрасного.
Оборудование.
Для данного исследования понадобились: система CAMAG TLC, включающая в себя аппликатор Linomag-5, сканнер CAMAG RLC и одиночные панорамные весы Shimandzu.
Химические препараты.
Аналитический качественный толуол, этилацетат, ледяная уксусная кислота, муравьиная кислота.(Были предоставлены из Индии, Мумбаи, Qualigens.)
Базовые подготовки.
Этанольный экстракт фильтрировали с помощью фильтра Millipone и выпарили до 10 мл.
Подготовка калибровки для диосгенина.
Было взято 300 г/мл рабочего стандартного диосгенина, полученного в метаноле. Был подготовлен калибровочных график от 600 до 1800 но/пятно и был проверен на воспроизводительность, линейность, действительность работы данного метода. Затем рассчитали линейность, коэффициент корреляции и коэффициент дисперсии.
Метод спецификации.
Покрытые селикагелем GF254 пластины использовались с толуолом:этилацет:GAA:муравьиная кислота (2:1:1:0,75) в качестве системы растворителя. Образец был замечен на предварительно обработанных ТСХ пластинках с использованием аппликтора Linomat 5. Вышеупомянутая формула была использована для разработки тонкслойной хроматографии. TLC были разработаны до 8 мм. Пластинка высушена под струей воздуха и отсканирована(194мм). Содержание диосгенина в этанольном экстракте Костуса Прекрасного определили путём сравнения площади хроматограммы этанольного экстракта с калибровочной кривой диосгенина.
Проверка метода.
Разработанный метод был проверен на линейность, точность, точность предел обнаружения, предела количественной оценки надёжности и прочности.
Результаты.