УФ – спектрофотометрические измерения проводят обычно в растворах. В качестве растворителя используется дистиллированная вода, кислоты, щелочи, спирты (метанол, этанол), некоторые другие органические растворители. Растворитель не должен поглощать в той области спектар, что и анализируемое вещество. Характер спектра (структура и положение полос поглощения) может изменяться в различных растворителях, а также при изменениях рН среды.
Метод УФ – спектрофотометрии включен в ГФ IХ, ГФ Х, а также в последние издания фармакопей почти всех стран для определения подлинности, чистоты и количественного определения лекарственных препаратов.
Изучение спектров поглощения химических веществ с разной структурой позволило установить, что основными факторами, обуславливающими поглощение света, являются наличие так называемых хромофоров, т. е. ненасыщенность (двойные и тройные связи), наличие карбонильной, карбоксильной, амидной, азо-, нитрозо-, нитро- и других функциональных групп. Каждая функциональная группа характеризуется поглощением в определенной области спектра. Однако имеется ряд факторов (присутствие нескольких хромофорных групп, влияние растворителя и др.), приводящих к смещению полос поглощения в сторону больших длин волн (батохромное смещение) или в сторону коротких длин волн (гипсохромное смещение). Кроме смещения может наблюдаться эффект увеличения (гиперхромный) или уменьшения (гипохромный) интенсивности поглощения.
В связи с этим для идентификации вещества по его УФ –спектру применяют обычно метод сравнения со спектром известного вещества, полученным в тех же условиях. Характеристикой спектра поглощения вещества является поглощение максимумов (минимумов) поглощения, а также интенсивность поглощения, что характеризуется величиной оптической плотности или удельного показателя поглощения.
Иногда для идентификации фармакопейных препаратов вместо абсолютных величин поглощения проводится отношение абсорбции при различных длинах волн. Инфракрасные (колебательные) спектры используются фармакопеями многих стран для идентификации лекарственных препаратов. ИК спектры большинства органических соединений в отличии от УФ спектров характеризуются наличием числа пиков поглощения.
Метод ИК –спектроскопии дает возможность получить наиболее полную информацию о строении и составе анализируемого вещества, позволяющую идентифицировать очень близкие по структуре соединения. В ГФ Х метод инфракрасной спектроскопии принят для идентификации лекарственных веществ с полифункциональными группами путем сравнения со спектрами стандартных образцов, снятыми в одиночных условиях.
ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
Люминесценция – это свечение атомов, молекул, ионов и других более сложных комплексов, возникающее в результате электронного перехода в этих частицах при их возвращении из возбужденного состояния в нормальное. Отсюда следует, что для возбуждения люминесценции необходимо проводить энергию извне, поскольку она теряется при излучении. Наиболее часто в аналитической практике используют фотолюминесценцию и хемилюминесценцию.
Люминесцентный анализ характеризуется высокой чувствительностью, это обусловлено тем, что люминесцентный метод относится к силовым, в котором выходной сигнал увеличивается с увеличением интенсивности источника излучения. Для большинства определяемых этим методом соединений пределы обнаружения не превышают 10-3 мкг/мл.
В идеальных условиях (высокие значения квантовых выходов люминесценции, молярных коэффициентов поглощения, отсутствие поправки на контрольный опыт и др.), даже применяя в качестве источника возбуждения лампы, удается достичь пределов обнаружения на уровне пикограммов в миллилитре. В модельных экспериментах с родамином 6 ис, сорбированном на отдельных частицах кремнезема диаметром 10 мкг, при использовании флуоресцентного микроскопа с лазером в качестве источника возбуждения удалось определить ≈ 8000 молекул красителя (≈ 6 * 10-18 г), сорбированных на индивидуальной частице. Высокая чувствительность определения, в ряде случаев большой диапазон определяемых содержаний – иногда до 4 порядков величин концентраций – при той же воспроизводимости результатов анализа, как и в молекулярной абсорбционной спектроскопии и предопределили развитие люминесцентного метода анализа.
Практическое применение
В неорганическом люминесцентном анализе наиболее распространены методы с использованием органических реагентов. Здесь есть свои особенности. Основная из них – более резко выраженная зависимость спектрально-люминесцентных свойств комплекса металла от природы и взаимного расположения электронных уровней лиганда и иона металла – комплексообразователя.
Наиболее распространенными люминесцентными реагентами являются 8-оксихинолин и его производные, оксиазо- и оксиазометиновые соединения, полиоксифлавоны, родаминтовые красители.
8-оксихинолин является неспецефическим реагентом, образующим флуорисцирующие хелаты более чем с 25 элементами, в том числе с Li, Ca, Mg, Ba, Al. Определению обычно предшествует экстракция, с помощью которой достигается требуемая селективность, поскольку спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции 8-оксихинолинатов практически не отличаются.
Другими большими группами флуоресцентных реагентов являются оксиазо- и оксиазолитивные соединеня (основания Шиффа). Исходные соединения этих классов – соответственно 2,2-диоксиазобензол и салицилиден-2-аминофенол. Их многочисленные производные широко применяют для определения Al, Ga, Mg и других элементов, образующие неокрашенные комплексы.
Полиоксифлавоны являются производными 2-фенил-1,4-бензопирозона. Они часто встречаются в природе в составе растительных компонентов. К соединениям этой группы относятся флавонол, 3-оксифлавон, морин, квертецин. Их применяют для определения Zn, Th, Al в сильнокислых растворах и Ве в щелочах.
Высокочувствительными и селективными флуориметрическими реагентами являются родаминовые красители. Их использование в неорганическом анализе основано на большей растворимости в органической фазе (чаще всего это бензол) ионных асоциатов катионов красителей с крупными анионами (в состав которых входит определяемый компонент) по сравнению с растворимостью простых солей реагента. Родаминовые красители применяют для определения Au, Ga, Hg, B и других элементов после переведения их в галогенидные ацидокомплексы.
Люминесцентное определение органических соединений основано главным образом на: а) прямых методах анализа по флуорисценции, с использованием различий в условиях возбуждения излучения и излучения определяемого соединения и сопутствующих компонентов; б) эффекте Шпольского; в) измерении фосфоресценции при комнатной температуре.
Эффект Шпольского – возникновение квазилинейчатых (комплексов) спектров люминесценции и поглощения сплощных органических молекул в специально подобранных растворителях, размеры молекул которых примерно совпадают с размерами молекул люминофора (чаще всего это Н-парафины) при низких температурах (жидкий азот или жидкий гелий). В таких условиях исследуемые молекулы изолированы друг от друга и местно закреплены в растворителе. Вследствие этого их электронно-колебательные спектры испускания и поглощения состоят не из широких полос, а из серии узких спектральных линий, напоминающих атомные спектры (из называют квазилинейчатыми спектрами) и обладают ярко выраженной индивидуальностью. Такие спектры наиболее характерны для полициклических ароматических углеводородов.
Методы анализа, основанные на эффекте Шпольского, позволяют определять одновременно несколько индивидуальных соединений (главным образом полициклических ароматических углеводородов) в их смеси с абсолютным пределом обнаружения до 10-11 г.
Квазилинейчатые спектры удается получить для ограниченного числа органических соединений. Для большинства же спектры излучения обладают слабо выраженной структурой. Получить более характеристичные спектры можно, используя синхронное сканирование. Это специфическая особенность метода молекулярной люминесцентной спектроскопии. При одновременном сканировании монохроматов возбуждение излучения и излучение с некоторым постоянным сдвигом ∆П в спектре синхронной люминесценции гипотетического соединения сигнал появится только при одновременном совпадении поглощения по длинам волн монохроматора возбуждения излучения с максимумом полосы спектра возбуждения и положения монохроматора люминесценции – с максимумом полосы спектра люминесценции.
Современная техника обработки информации позволяет получать трехмерные спектры. С использованием фотоприемников - видиконов можно измерить один такой спектр за время меньше 20 мс. Трехмерный спектр люминесценции легко может быть преобразован в двухмерный. Двухмерный спектр возбуждения люминесценции представляет собой набор горизонтальных сечений соответствующего трехмерного спектра. Двухмерные спектры напоминают отпечатки пальцев (их так часто называют), они индивидуальны для каждого соединения, их используют для быстрой идентификации органических соединений.
Еще одно интенсивно развивающееся направление в люминесцентном органическом анализе – фосфоресценция при комнатной температуре. Появление фосфоресценции при комнатной температуре связано с уменьшением скорости тушения кислородом триплетных состояний молекул сорбированных органических соединений. Это уменьшение обусловлено снижением подвижности молекул вследствие образования водородных или более прочных связей сорбат – сорбент.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Определение активности адреналина основано на его способности вызывать повышенное артериальное давление у кроликов.
Стандартный препарат. Стандартным препаратом при испытании адреналина является синтетический кристаллический адреналин, сохраняемый в запаянных ампулах оранжевого стекла в защищенном от света месте. Вскрытые ампулы должны храниться в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора.
Описание метода. Для опытов берут здоровых кроликов обоего пола, весом 2,5 – 3 кг. Опыт проводят под уретановым (1г на 1 кг веса животного) или эфирным наркозом.
У кроликов на одной стороне отпрепаровывают яремную вену, а на противоположной стороне шеи - сонную артерию. Артерию соединяют с ртутным манометром при помощи каучуковой трубки, наполненной противосвертывающим раствором. Введение препаратов производят в яремную вену через вставленную в нее канюлю или при помощи очень тонкой иглы. За 15 минут до начала испытания кролику вводят внутривенно 1 мл 0,5% раствора атропина сульфата. Введение отдельных доз раствора адреналина производят с постоянной скоростью (1 мл в 5 сек). Каждое новое введение производят через 5 мин, считая с момента возвращения к норме кривой кровяного давления после предыдущего введения. Общий объем вводимой дозы не должен превышать 1 мл. Измерение высоты подъема производят от истинной абсциссы.
Целью опыта является определение доз, вызывающих подъем кровяного давления на одну и ту же высоту при введении испытуемого и стандартного растворов.
Испытание 0,1% раствора адреналина. Препарат разводят 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:50 для получения раствора 1: 50000.
Стандартный препарат растворяют в 0,1 н растворе соляной кислоты в отношении 1: 100. Полученный раствор доводят до концентрации 1: 1000. Путем дальнейшего разведения этого раствора в 50 раз 0,9% раствором хлорида натрия достигают нужной для опыта концентрации 1: 50000.
Определив сначала дозу раствора стандартного препарата, способную вызвать субмаксимальный для данного животного подъем кровяного давления, подбирают дозу исследуемого раствора, способную дать то же действие. Подыскав соответствующие дозы повторным введением растворов исследуемого и стандартного препаратов адреналина, убеждаются в одинаковой силе действия найденных доз растворов.
Зная содержание стандартного препарата в найденной дозе стандартного раствора, вычисляют содержание адреналина в исходном растворе испытуемого образца.
Для каждого испытания требуются средние данные, полученные при опытах не менее чем на 3-х кроликах.