Структурная и изоферментная характеристика лакказ




ВВЕДЕНИЕ

 

Лакказа Trametes versicolor обладает высоким окислительным потенциалом и относительно низкой субстратной специфичностью. На настоящий момент, она активно используется в некоторых технологических процессах. Ее классическими субстратами являются многоатомные фенолы. Активный центр лакказы представлен четырьмя ионами меди, которые меняют свою степень окисления по ходу процесса. Они восстанавливаются до Cu+ за счет окисления многоатомного фенола, а затем окисляются до Cu2+ при восстановлении молекулярного кислорода. Механизм процесса радикальный и остается на настоящий момент не до конца изученным. Не исключена возможность как выхода из сферы активного центра фермента радикальных интермедиатов и осуществления неферментативных реакций окисления субстратов, так и образования активных форм кислорода в неферментативных реакциях, однако посвященные изучению этих аспектов работы практически отсутствуют. Знание механизма лакказного окисления субстратов в активном центре фермента и за его пределами, доли осуществляющихся параллельно с ферментативными неферментативных радикальных реакций, позволит увеличить число технологических схем с участием лакказ. В связи с чем, проблема исследования механизма реакции лакказного окисления субстратов с участием медиаторов и без на настоящий момент остается актуальной.

С учетом выше сказанного, целью работы было исследование особенностей механизма ферментативной окислительной трансформации фенолов молекулярным кислородом. Основные задачи: подтвердить возможность возникновения хемилюминесцентного свечения в реакции лакказного окисления пирогаллола; осуществить подбор условий проведения эксперимента для исследования кинетики хемилюминесценции; изучить влияние добавок, концентрации субстрата и фермента, pH буферного раствора на кинетику хемилюминесценции при окислении пирогаллола.

Объект исследования – реакция окисления пирогаллола молекулярным кислородом в присутствии лакказы Trametes versicolor, сопровождающаяся хемилюминесцентным свечением.

Предмет исследования – механизм окислительного лакказного превращения фенолов молекулярным кислородом в водной среде.

Методы исследования: хемилюминесцентный – для изучения кинетики хемилюминесценции в процессе окисления пирогаллола; спектрофотометрический – для изучения кинетики расходования пирогаллола и накопления 3-гидрокси-1,2-бензохинона; pH-метрия – для измерения pH буферных растворов, весовой метод – для приготовления растворов необходимой концентрации.

Научная новизна полученных результатов: впервые обнаружено хемилюминесцентное свечение в реакции лакказного окисления пирогаллола в водной среде; получены экспериментальные подтверждения, указывающие на радиальный механизм реакции превращения фенолов под действием лакказы и того, что окислительные процессы в реакционной смеси реализуются ферментативным и неферментативным путем; сделана попытка объяснить механизм хемилюминесцентного свечения при ферментативном окислении многоатомных фенолов.


 

Ферментативное и неферментативное окисление фенолов в водных средах (Обзор литературы)

 

Структурная и изоферментная характеристика лакказ

Лакказа была открыта [1, 2] в 1883 году при исследовании выделений лакового дерева, быстро твердеющих на воздухе. Название ферменту было дано позже, в 1894 году, французским биохимиком Габриелем Бертраном, впервые выделившим и очистившим лакказу [1]. В последствии было описано и подробно изучено множество изоферментных форм лакказы из различных источников. Так, по состоянию на 2013 год, у сотен организмов описан и расшифрован ген, в котором записана информация о первичной аминокислотной последовательности данного фермента [3].

Лакказа (EC 1.10.3.2, пара-бензендиол: кислород оксидоредуктаза, п-дифенол оксидаза) относится к семейству оксидаз, содержащих несколько атомов меди. Встречается во многих микроорганизмах, грибах, растениях [1, 2]. Лакказы из различных организмов могут существенно отличаться по своим свойствам. Наиболее близкими к лакказе ферментами являются человеческий церулоплазмин, растительная аскорбатоксидаза, металлоксидаза дрожжей [3].

Активный центр лакказы из состоит из моноядерного медного центра Т1 и трехъядерного кластера Т2/Т3. Субстрат-связывающий центр, в котором находится Т1 ион меди, располагается между 2 и 3 доменом, а Т2/Т3 кластер - в полости между 1 и 3 доменами (рис. 1.1) [4].

Окислительный центр лакказы T1 представлен ионом меди, связанным с двумя функциональными группами гистидина и одной — цистеина, иногда также с одной группой метионина. Кислород-редуцирующий центр представлен трехядерным медным центром (TNC), состоящим из пары антиферромагнитно-соединённых ионов меди, связанных с гистидинами (сайт T3) и из иона меди, связанного с парами гистидин/вода (сайт T2).

 

 

Рис. 1.1 Схематическое изображение трехмерной структуры лакказы, 1,2,3 – домены.

 

Ион меди Т1 координируется двумя гистидиновыми остатками и одним цистеиновым, причем и ион меди, и координирующее его атомы азота и серы лежат в одной плоскости (рис. 1.2). Кислород-восстанавливающий центр Т2/ТЗ находится на расстоянии около 12 Å от поверхности молекулы фермента и локализован между 1 и 3 доменами [4].

 

Рис. 1.2 Пространственное строение Т1 центра лакказы

 

Три иона меди в кластере Т2/ТЗ образуют почти равнобедренный треугольник. На карте электронной плотности локализован в центре кластера кислородный лиганд О3 (рис. 1.3). Между двумя ионами меди в ТЗ центре находится кислородный мостиковый лиганд О1. Следует отметить, что этот кислородный лиганд присутствует во всех структурах лакказ.

 

 

Рис. 1.3 Пространственное строение Т2/Т3 кластера лакказы

 

Лакказа катализирует четырехэлектронное восстановление молекулярного кислорода до воды. Первичным акцептором электронов является Т1 центр. Теоретический расчет показал, что перенос электронов от иона меди первого типа может осуществляться двумя путями: через связи аминокислотных остатков или туннельным переносом (пространственно) [5]. Трипептид His-Cys-His играет роль "мостика" между ионом меди первого типа и трехъядерным медным кластером, обеспечивая наиболее благоприятный путь переноса электронов. Перенос электрона на Т3 кластер завершает первую стадию катализа, за которой следует стадия восстановления кислорода с образованием двух молекул воды. В каталитическом цикле лакказы участвуют несколько взаимопереходящих форм фермента, а именно пероксо-форма, полностью восстановленная форма, окисленная "покоящаяся" форма и нативный интермедиат [5]. Взаимные переходы промежуточных форм лакказы и время их жизни в растворе в значительной степени зависят от рН и температуры. Согласно общепринятой классификации промежуточных форм фермента [5], нативным интермедиатом является такая форма, у которой все ионы меди трехъядерного медного кластера находятся в окисленном состоянии и каждый из них имеет кислородный лиганд О1, О2 и О3 ("трехмостиковая" модель). Окисленная "покоящаяся" форма отличается от нативного интермедиата отсутствием кислородного лиганда О3.

Восстановление кислорода может происходить двумя путями. Первый путь предполагает участие в катализе нативного интермедиата, который, получая электрон от Т1 центра, переходит в окисленную "покоящуюся" форму с сопутствующим отщеплением одной молекулы воды. Второй путь восстановления молекулярного кислорода предполагает перестройку Т2/ТЗ кластера окисленной "покоящейся формы после переноса электрона с Т1 центра с образованием "мостика" между Т31 и Т2 ионами меди. Такая конформация ТЗ центра способна связывать кислород с образованием «мостика» между Т31 и Т32. При этом остальные кислородные лиганды (О1 и О2) находятся в тех же положениях. Таким образом, образуется нативный интермедиат, который после протонирования и отщепления молекулы воды может переходить в окисленную "покоящуюся" форму. Кислородным лигандом Т2 у данной формы становится О1, а кислородный мостиковый лиганд между Т31 и Т2 отщепляется в составе молекулы воды.

Типичный реакционный цикл фермента превращает одну молекулу кислорода в две молекулы воды, при этом окисляются 4 молекулы субстрата. В результате реакции некоторые субстраты могут димеризоваться или полимеризоваться. В качестве субстата могут выступать различные фенолы, ароматические амины и даже ионы металлов. Лакказы имеют низкую субстратную специфичность. Константа Михаэлиса для окисления фенолов и ароматических аминов обычно порядка миллимолей [3].

Типичная катализируемая реакция:

Лакказы используются в биотехнологических процессах, таких как биоремедиация и детоксикация загрязнённых почв и стоков [1], органический катализ, получение синтетических волокон из древесины [3]. Используются также в пищевой и пивоваренной промышленности для улучшения свойств теста, улучшения вкусовых качеств пива и продления сроков годности соков за счёт торможения процессов окисления полифенолов в них.

 



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2019-04-30 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: