Задание 1. Получение разведенного препарата амилазы слюны
1. Студент-доброволец из каждой пары, ополоснув рот водой 2-3 раза, собирает в центрифужную 1,5 мл слюны.
2. Под контролем лаборанта отбирается определенное количество и разбавляется водой в зависимости от необходимого разведения: например если нужно получить разведение 1:9, отбирается точно 1 мл слюны из пробирки и переносится в центрифужную пробирку и доводится до объем до 10 мл.
3. При необходимости фильтровать раствор в стакан, отметив разведение слюны в 10 раз.
Оборудование и химреактивы:
Центрифуга лабораторная до 3000 об/мин,
КФК3
крахмал 0,2 %,
раствор Люголя.
Задание 2. Определить активность альфа-амилазы
Перед началом работы определить активность амилазы слюны. Для чего в пробирке смешать 2 мл 0,2 % -ного раствора крахмала и 2 мл разбавленной 1:25 отцентрифугированной слюны. Смесь оставить при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала проводить по реакции с раствором йода. Для чего через каждую 1 минуту отбирать по 3-4 капли гидролизата и вносить его в пробирку с заранее налитым туда 0,5 мл воды и 1-2 каплями раствора Люголя. При появлении красно-бурой или красной окраски наблюдение прекратить. Желательно, чтобы гидролиз крахмала до эритродекстринов (красные тона окраски) происходил приблизительно за 5-10 минут. Если гидролиз идёт быстрее, то слюну нужно разбавить ещё в 2 раза и опыт повторить. Найденное разбавление слюны использовать для работы.
* При гидролизе крахмал распадается, давая последовательно декстрины, мальтозу и глюкозу. В начале гидролиза образуются амилодекстрины, дающие синее окрашивание с йодом, затем эритродекстрины, дающие с йодом красно-бурое окрашивание и, наконец, ахродектрины, не окрашивающиеся йодом. Продуктом гидролиза последних является мальтоза, которая распадается в дальнейшем на две молекулы глюкозы.
Таблица – Цветные реакции декстринов с йодом
| Декстрин (С6Н10О5) k | Степень полимеризации k | Окраска комплекса с йодом |
| Амилодекстрины | >30 | Синяя или фиолетовая |
| Эритродекстрины | 25–29 | Красная |
| Ахродекстрины | 21–24 | Желто-коричневая |
| Мальтодекстрины | <20 | Отсутствие реакции |
1 
2 
3
(1 – из картофеля, 2 – из кукурузы, 3 – из пшеницы)
Рисунок – Зерна крахмала из разных природных источников под микроскопом
| Углеводы | Mr | Степень полимеризации | Редуцирующая способность,% |
| Растворимый крахмал | 0,073 | ||
| Амилодекстрины | 0,5 | ||
| Эритродекстрины | 2,5 | ||
| Ахродекстрины | 5,0 | ||
| Тетрасахариды | |||
| Трисахариды | |||
| Мальтоза | |||
| Глюкоза |
Задание 3. Определение константы Михаэлиса (КМ) реакции гидролиза крахмала под действием амилазы
Реакция, катализируемая амилазой, представляет собой реакцию расщепления крахмала ферментом до глюкозы. Для определения кинетических характеристик реакции используется график Лайнуивера – Берка (график уравнения Михаэлиса-Ментен в обратных координатах).
1\V = Km\Vmax х 1\[S] + 1\Vmax
Используя его, величину Км можно определить либо по наклону прямой и длине отрезка, отсекаемого на оси у, либо по длине отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений на оси х. Поскольку [S] измеряют в молях/литр, Км имеет ту же размерность. Скорость V0 может быть выражена в любых единицах, поскольку Км не зависит от [Е]. График Лайнуивера-Берка позволяет определять Км по относительно небольшому числу точек, поэтому он часто используется для расчета этого параметра.
Определение Km имеет большую практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих Км фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максимальная скорость Vmax будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это немаловажное обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Знание величины Км позволяет определить, какое количество субстрата следует внести в реакционную смесь для определения Vmax. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое применение при анализе характера действия ингибиторов на ферментативные реакции.
Оборудование и химреактивы:
КФК3, крахмал 0,1 %, раствор.
Ход работы:
1. В 9 пробирок, начиная со второй вносят по 1 мл дистиллированной воды.
2. В первую пробирку вносим 1 мл крахмала 0,1 %. Во вторую пробирку наливают 3 мл 0,1 % крахмала, тщательно перемешивают. После чего отбирают 3 мл разведенного крахмала и переносят в третью пробирку, тщательно перемешивают и процедуру повторяют. Таким образом, получаем ряд разведений крахмала в соответствии с таблицей.
3. Вносим в первую пробирку 1 мл разведенной слюны и сразу 100 мкл раствора Люголя. Процедуру повторяем с другими пробирками.
4. Замеряем оптическую плотность в пробирках при длине волны 620 нм, начиная с первой желтой (то есть с конца/середины ряда), и заканчивая последней синей. Вносим данные в таблицу в соответствии с концентрацией крахмала.
5. Рассчитываем максимальную скорость и ее обратную величину.
6. Строим график зависимости обратной величины скорости реакции от обратной величины концентрации субстрата (см. рис. 1). На графике определяют величину Kм.
| Крахмал (S), % | Контроль, D | Опыт, D | Скорость переваривания (Dk-Dопыт) V | 1/S | 1/V |
| 0,1 | |||||
| 0,075 | 13,3 | ||||
| 0,056 | 17,8 | ||||
| 0,042 | 23,7 | ||||
| 0,032 | 31,6 | ||||
| 0,024 | 42,1 | ||||
| 0,018 | 56,2 | ||||
| 0,013 | 74,9 | ||||
| 0,010 | 99,9 | ||||
| 0,008 | 133,2 | ||||
| 0,006 | 177,6 |
7. Делаем две контрольные пробирки: 1) 2 мл воды и 100 мкл раствора Люголя; 2) 1 мл воды, 1мл крахмала и 100 мкл раствора Люголя.
Оформление работы:
Полученные результаты оптической плотности представить в таблице 3.
Рис. 1 График зависимости обратной величины скорости реакции от обратной величины концентрации субстрата
Вывод: написать, что такое константа Михаэлиса и каков её физический смысл? Сравнить полученные величины константы Михаэлиса в разных подгруппах.