Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения, могут быть применены и для других бактериальных клеток. Прокариотическая, как и любая другая бесклеточная система биосинтеза белка, должна содержать несколько обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2) матричный полирибонуклеотид (мРНК или синтетические полинуклеотиды); 3) аминоацилированные тРНК; 4) GTP в качестве источника энергии; 5) одновалентные (К+ или NH4+) и двухвалентные (Mg2+ или Са2+) катионы, а также буферные вещества для поддержания рН системы в физиологических пределах.
Одним из наиболее важных условий функционирования бесклеточных систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще всего используют экстракты соответствующих клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде, суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат центрифугируют при 30 000 g. При этом в супернатанте (так называемом SЗО-экстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся бактериальные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.
В том случае, если разрушение бактериальных клеток проводят жесткими методами с применением ультразвука, растирания со стеклянными бусами и т.п., освобождение от эндогенных нуклеиновых кислот становится сложной задачей и требует фракционирования экстрактов с помощью ионообменной хроматографии. При такой хроматографической очистке фракции S1OO из нее удаляются все аминоацилированные и свободные молекулы тРНК. Поэтому при реконструировании бесклеточной белоксинтезирующей системы к объединенным фракциям рибосом и S1OO-экстракта добавляют препарат очищенной суммарной тРНК.
|
|
Экстракты бактериальных клеток S30 и S1OO, кроме всех необходимых факторов трансляции, содержат и основные компоненты системы транскрипции, включая РНК-полимеразу, фактор терминации транскрипции r, CRP-белок и т.п. Поэтому для создания ДНК-зависимой системы сопряженной транскрипции и трансляции, в которой происходит полная экспрессия генов, находящихся под контролем бактериальных регуляторных элементов, как правило, не требуется введения в нее дополнительных белков. Достаточно внесения в систему экзогенной ДНК-матрицы, транскрибируемой бактериальной РНК-полимеразой, а также четырех рибонуклеозидтрифосфатов, чтобы в ней начала активно синтезироваться мРНК и одновременно транслироваться рибосомами. В итоге в таких бесклеточных системах в ряде случаев удается синтезировать высокомолекулярные белки, обладающие ферментативной активностью.
Экстракты бактериальных клеток содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков in vitro, разрушая мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих затруднений в бесклеточных системах часто используют экстракты мутантных бактериальных клеток, дефектных по РНКазам и полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы при необходимости вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п.
|
|
Не существует больших ограничений на первичную структуру мРНК, транслируемых в бактериальных бесклеточных системах. Единственным необходимым условием их эффективной трансляции является отсутствие совершенной вторичной структуры или каких-либо особо прочных кооперативных спиральных участков. Вторичную структуру транслируемых мРНК обычно разрушают кратковременным прогреванием с последующим быстрым охлаждением непосредственно перед внесением ее в пробы.
GTP относится к обязательным компонентам бесклеточной белоксинтезирующей системы. Он не может быть заменен на любой другой из известных рибонуклеозидтрифосфатов и необходим для мРНК-зависимого связывания аминоацил-тРНК с рибосомами и транслокации. Поскольку при трансляции происходит непрерывное расходование GTP, а образующийся при этом GDP является ингибитором трансляции, в процессе функционирования бесклеточной системы осуществляют постоянную регенерацию GTP. Для этого применяют АТР в качестве донора фосфатных групп, которая, в свою очередь, регенерируется путем переноса фосфатной группы вводимого в бесклеточную систему фосфоэнолпирувата с помощью пируватфосфокиназы. Энергия макроэргических связей АТР используется также при аминоацилировании тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами. В том случае, если создается бесклеточная система сопряженной транскрипции и трансляции, для осуществления синтеза РНК в нее вводятся еще два недостающих рибонуклеозидтрифосфата: UTP и СТР.
|
|
Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия. Наиболее существенным фактором в этом случае является концентрация ионов Mg2+. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg2+ в системе на 1–2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. При этом влияние ионов Mg2+ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, по-видимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+. В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са2+ и даже Мn2+, а также частично замещены полиаминами: спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков.
Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов K+ или NH4+, оптимальные концентрации которых составляют ~100 мМ. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов Сl-. Ионы Mg2+, К+ и NH4+ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме, а также обеспечения других их функций.
Несмотря на то что в бесклеточной трансляции чаще всего находят применение системы с использованием SЗО- и S1OO-экстрактов с добавленными рибосомами, современный уровень знаний молекулярных механизмов трансляции позволяет получать бесклеточные белоксинтезирующие системы из полностью очищенных компонентов. Однако создание таких систем является трудоемким процессом, поэтому их применяют только в аналитическом варианте для решения специальных задач.
Эукариотические системы
Несмотря на относительную простоту получения бактериальных белоксинтезирующих систем, их использование ограничивается трансляцией бактериальных и фаговых мРНК или рекомбинантных последовательностей нуклеотидов, находящихся под контролем генетических регуляторных элементов бактерий или бактериофагов. В этой связи возникла необходимость в разработке бесклеточных систем биосинтеза белка, пригодных для непосредственной трансляции мРНК высших организмов.
В настоящее время наиболее часто применяемыми системами такого рода являются белоксинтезирующие системы из ретикулоцитов кроликов, зародышей пшеницы и культивируемых соматических клеток различного происхождения. При этом системы всех трех типов могут быть использованы почти с одинаковым успехом для трансляции разнообразных мРНК и, как правило, такие системы не обнаруживают видоспецифичности. Основные принципы конструирования прокариотических белоксинтезирующих систем применяют и для получения систем биосинтеза белков высших организмов. Специфика последних связана, прежде всего, с биологическими особенностями объектов, которые служат источником белковых компонентов систем, а также с различиями механизмов биосинтеза белка у прокариот и эукариот.
Ретикулоциты – безъядерные предшественники эритроцитов человека и животных, осуществляют активный синтез гемоглобина и в связи с этим обладают всеми необходимыми компонентами белкового синтеза. В то же время отсутствие ядер в таких клетках дает возможность получать бесклеточные экстракты, минимально загрязненные геномной ДНК. Эти особенности ретикулоцитов животных делают их излюбленным источником бесклеточных экстрактов, способных осуществлять эффективную трансляцию разнообразных экзогенных мРНК.
Все основные компоненты, необходимые для функционирования бактериальных бесклеточных систем биосинтеза белка, должны присутствовать и в бесклеточной белоксинтезирующей системе из ретикулоцитов кроликов. Однако необходимо отметить две существенные особенности такой системы. Во-первых, для регенерации АТР в качестве доноров фосфатных групп используют креатинфосфат – универсальный аккумулятор энергии в макроэргических связях у большинства позвоночных, а сам перенос групп осуществляется вводимой в систему креатинфосфокиназой. Во-вторых, для предотвращения ингибирования трансляции в процессе синтеза белка в систему вводят гемин (механизм его стимулирующего действия обсуждался в первой части книги).
Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза белка. Различия заключаются главным образом в методах получения бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем перед другими являются возможность длительного хранения и доступность исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует проведения экспериментов с лабораторными животными.
Несмотря на то что разные эукариотические бесклеточные белоксинтезирующие системы активно транслируют гетерологичные мРНК, гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно. Например, глобиновые мРНК используются в синтезе белка в 7–8 раз лучше лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников китайских хомячков. Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции определенных мРНК. Факты такого рода необходимо учитывать при выборе бесклеточной системы для решения конкретных экспериментальных задач.
Проточные системы
Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные системы существовали только в аналитическом варианте и были функционально активны на протяжении короткого времени (40–60 мин). Для всех описанных выше систем характерен малый выход синтезируемого белка (не более 1 мкг на 1 мл экстракта), и на 1 молекулу мРНК в них синтезируется лишь одна–две молекулы полипептида.
Значительный прогресс в этой области исследований был достигнут в лаборатории А.С. Спирина в 1988 г. Здесь с помощью простых усовершенствований удалось получить эффективную бесклеточную белоксинтезирующую систему. В их модификации бесклеточные экстракты бактериальных или эукариотических клеток помещают в ячейку, закрытую с двух сторон полупроницаемыми мембранами. Размер пор позволяет проходить через мембраны вместе с током жидкости низкомолекулярным химическим веществам и небольшим белкам. Содержимое ячейки, в которой имеются все компоненты, необходимые для бесклеточной трансляции, инкубируют при обычной температуре. При этом с одной стороны в такую ячейку-реактор со скоростью ~1 мл/ч непрерывно поступают ингредиенты, расходуемые в процессе биосинтеза белка (аминокислоты, АТР, GTP), а с другой – из нее выходят синтезированные белковые продукты (если их молекулярная масса и отсутствие способности к агрегации позволяют пройти через поры мембраны).
Такое простое усовершенствование бесклеточной системы сильно изменило характер ее функционирования. Биосинтез белка в ней может продолжаться непрерывно в течение нескольких десятков часов, причем на одну молекулу транслируемой мРНК синтезируются сотни копий полипептидных цепей белков, суммарный выход которых может достигать 200 мкг и более на 1 мл бесклеточного экстракта.
С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирующей системы стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной деградации протеиназами или образующие тельца включения в живых клетках. Проточная система может быть полезна также для получения белков, обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных полипептидов, для которых нежелательны артефактные посттрансляционные модификации, происходящие in vivo. Недавно в таких системах удалось получить препаративные количества функционально активного интерлейкина 6 человека.