После обсуждения основных экспериментальных приемов, используемых в современной генной инженерии, становится ясно, каким образом можно решить одну из основных методических задач молекулярной генетики, а именно: выделить требуемый ген и заставить его работать в новых для него генетических условиях. Такая задача наиболее просто решается в случае бактериальных и вирусных генов, поскольку геном этих микроорганизмов невелик. Кроме того, бактериальные гены, как правило, не содержат интронов и даже гетерологичные бактериальные гены хорошо экспрессируются в клетках E. coli. Но и клонирование эукариотических генов в настоящее время представляется вполне посильной задачей. Приняв решение о клонировании какого-либо эукариотического гена, прежде всего необходимо ответить на вопрос: нужна ли экспрессия рекомбинантного гена в клетках микроорганизмов или же можно ограничиться исследованием его структуры? Очевидно, что в первом случае нужно думать о создании клонотеки безинтронных кДНК, а во втором – клонотеки геномной ДНК исследуемого объекта, что в ряде случаев технически менее сложно. Задача становится более трудной, если отсутствуют сведения о первичной структуре клонируемого гена. Тогда единственным источником получения частичной информации о последовательности его нуклеотидов может быть кодируемый этим геном белок.
Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд олигонуклеотидных зондов, которые далее используют для скрининга клонотеки генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК, так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная длина которых может значительно (на два–три порядка) превышать таковую значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек особенно остро встает вопрос об их репрезентативности, поскольку внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК, гибридизующейся с упомянутыми выше олигонуклеотидными зондами, можно идентифицировать кодируемый кДНК белок после ее экспрессии с использованием специфических антител. Альтернативно: кодирующий потенциал клонированной кДНК определяют после ее гибридизации с суммарной мРНК, выделяя фракцию мРНК, задерживаемой иммобилизованной кДНК на носителе, с последующей трансляцией мРНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе. Кроме того, если клонированная кДНК кодирует мРНК исследуемого белка, то они и в растворе образуют специфический ДНК-РНК-гибрид, и мРНК перестает участвовать в трансляции в бесклеточной системе (метод прерванной трансляции). Наличие или отсутствие белкового продукта бесклеточной трансляции легко обнаружить с помощью специфических антител. После проведения таких исследований можно точно идентифицировать клонированную кДНК и использовать ее в качестве зонда для выделения целого гена из клонотеки геномной ДНК. Одновременно возможна экспрессия клонированной кДНК в клетках микроорганизмов или в гомологичных эукариотических клетках.
|
|
По-прежнему уникальной задачей, которая по плечу лишь большим международным коллективам, остается клонирование неизвестных генов животных и растений, функционирование которых можно заметить по сложным фенотипическим признакам, например симптомам системного наследственного заболевания. При выделении таких генов из генома человека работа начинается с проведения скрупулезного анализа сцепления исследуемого фенотипического признака и какого-либо полиморфного молекулярного маркера, например редкого аллеля HLA или минисателлитного локуса всех членов семьи больного. После обнаружения сцепленных маркеров задача сводится к клонированию крупных фрагментов ДНК, включающих эти маркеры, их секвенированию, выявлению открытых рамок считывания, в которых пытаются обнаружить мутации, отсутствующие у здоровых индивидуумов. В случае удачи дальнейшая работа может проводиться по одной из вышеприведенных схем и должна закончиться идентификацией гена и его белкового продукта.
|
|
Примерно такой путь исследований в генной инженерии привел за последние 20 лет к клонированию множества генов, в том числе и неизвестных ранее, определению их структуры и особенностей функционирования. Аналогичные подходы легли в основу новых направлений молекулярной генетики. О некоторых из них речь пойдет ниже в других главах книги.