Развитие технологий геномного секвенирования, биоинформационного анализа и создания рекомбинантных ДНК, а также знания о генетике, физиологии и биохимии бактерий являются мощной базой для практического применения рекомбинантных микроорганизмов в практических целях.
ДНК-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. Информация о любом организме заключена в его геноме. Патогенность бактерий определяется наличием в геноме специфических генов. Последовательности нуклеотидов этих генов могут служить в качестве диагностических зондов. В основе такой диагностики
лежит ДНК-гибридизация. ДНК-мишень фиксируют на мембране, затем на мембрану наносят меченый ДНК-зонд, проводят гибридизацию и выявляют гибридные молекулы путем идентификации метки. В качестве ДНК-мишени используют образцы крови, мочи, кала, смыв с зева без предварительной очистки. Гибридизационный зонд должен быть высокоспецифичен. Для его получения используют ДНК патогенов, которую предварительно расщепляют рестриктазами, а затем фрагменты рестрикции клонируют в плазмидах. Проводят скрининг рекомбинантных ДНК с применением патогенных и непатогенных штаммов. Те, что гибридизуются с ДНК патогенов и не гибридизуются с непатогенной ДНК служат видоспецифичными зондами. Получены ДНК-зонды ко многим патогенам, бактериям и вирусам. Сегодня с их помощью можно диагностировать Спид, гепатиты, малярию, сальмонелез, гастроэнтериты и др.
ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека. ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, но самый распространенный сегодня - метод ПЦР. На рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления возбудителей различных заболеваний, мутаций генов человека, животных и растений. ПЦР-анализ становится все более востребованным, поскольку расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда патогенных и условно патогенных микроорганизмов и выделены специфические последовательности патогенов. В последние годы появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: мультипраймерная ПЦР, гнездовая ПЦР, ПЦР in situ, ПЦР в режиме реального времени и др. При использовании метода ПЦР для идентификации РНК, а не ДНК применяется модифицированный ОТ-ПЦР метод.
ДНК-диагностика - это быстро развивающееся направление. Использование ПЦР и специфических зондов существенно повышает чувствительность тестов
и позволяет применять нерадиоактивные хромогенные, хемилюминесцентные и флуоресцентные системы регистрации. Во многих случаях для выявления мутации или экзогенной ДНК инфекционного агента в исследуемом образце достаточно провести ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов. С помощью ДНК-диагностики можно будет выявлять наиболее распространенные генетические и инфекционные заболевания, а также новообразования.
Лекарственные средства. До появления технологии рекомбинантных ДНК лекарственные препараты на основе белков человека получали в небольших количествах, и их производство обходилось очень дорого. С помощью новой геномной технологии препараты получают в количествах, достаточных для тестирования и применения в клинике. В настоящее время на основе кДНК различных белков человека получают лекарственные препараты для лечения различных заболеваний человека. Ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет.
Инсулин. Для получения кДНК генов целевых белков и клонирования их в векторные системы применяют несколько экспериментальных подходов. Во- первых, это использование тканей, насыщенных искомым белком. Примером такого подхода служит получение рекомбинантного человеческого инсулина. Впервые кДНК была получена на основе мРНК из клеток ткани поджелудочной железы, из которых выделяли суммарную мРНК, в составе которой доминировала мРНК инсулина, т.е. основным белком, синтезируемым клетками поджелудочной железы, является инсулин, и 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно его. На основе мРНК получали кДНК инсулина, клонирование которой в бактериальный вектор позволило разработать биотехнологию получения инсулина на основе рекомбинантных бактерий E.coli.
Интерфероны. Такой подход был неприменим для белков, количество которых в клетках чрезвычайно мало и место синтеза точно неизвестно. В этом
случае использовалась техника обогащения: ее впервые применили при получении альфа, бета- и гамма-интерферонов (ИФ) человека, имеющих важную терапевтическую значимость. Выделение кДНК интерферонов проводили из лейкоцитов человека. Сначала получали мРНК из лейкоцитарных клеток. Далее мРНК фракционировали по размерам и проводили и обратную транскрипцию. Полученные кДНК клонировали на плазмидах pBR322 в E.coli. Клоны делили на группы, которые тестировали путем гибридизации с неочищенным препаратом ИФ-мРНК. Из образовавшихся гибридов, содержащих клонированную ДНК и мРНК, выделяли мРНК и проводили ее трансляцию в бесклеточной системе синтеза белка. Определяли интерфероновую противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявлявшие активность вновь тестировали и повторяли до тех пор, пока не идентифицировали клон, содержащий полноразмерную ИФ-кДНК человека. Так получили гены несколько разных типов интерферонов, которые легли в основу разработки биотехнологии получения ИФ-альфа, ИФ-бета и ИФ-гамма.
ИФ-альфа и ИФ-бета синтезируются клетками, обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИФ-гамма вырабатывается в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФ-альфа кодируется семейством генов, включающим как минимум 15 неаллельных генов, в то время как ИФ-бета и ИФ-гамма кодируются одним геном каждый. Подтипы ИФ-альфа проявляют разную специфичность. Например, при проверке эффективности ИФ-альфа-1 и ИФ-альфа-2 на обработанной вирусом линии клеток быка эти интерфероны проявляют сходную противовирусную активность, в случае же обработанных вирусом клеток человека ИФ-альфа-2 оказывается в семь раз активнее, чем ИФ- альфа-1. Если противовирусная активность проверяется на клетках мыши, то ИФ-альфа-2 оказывается в 30 раз менее эффективным, чем ИФ-альфа-1. В связи с тем, что ИФ различаются по уровню и специфичности противовирусной активности были предприняты попытки создать ИФ с комбинированными свойствами комбинацией фрагментов генов разных ИФ. Ожидалось
образование гибридных ИФ-белков с другими свойствами, чем у каждого из исходных белков. Сравнение последовательностей кДНК ИФ-альфа-1 и ИФ- альфа-2, показало, что они содержат одинаковые сайты рестрикции в позициях 60, 92 и 150. После расщепления обеих кДНК в этих сайтах и последующего лигирования фрагментов было получено несколько гибридных генов. Эти гены экспрессировали в E.coli, синтезированные белки очистили и исследовали их биологические функции. Проверка защитных свойств гибридных ИФ на культуре клеток млекопитающих показала, что некоторые из них проявляют большую активность, чем родительские молекулы. Кроме того, многие гибридные ИФ индуцировали образование 2'-5'-олигоизоаденилат-синтетазы в контрольных клетках. Этот фермент участвует в синтезе 2'-5'-связанных олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщепляющую вирусную мРНК. Другие гибридные ИФ проявляли большую, чем родительские молекулы, антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека.
Гормон роста. Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для усиления или ослабления биологического свойства белка. Например, нативный гормон роста человека (ГРЧ) связывается в разных типах клеток как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецептором. Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединение ГРЧ к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых аминокислот (His-18, His-21 и Glu-174) — лигандов для ионов Zn2+, необходимых для высокоаффинного связывания ГРЧ с пролактиновым рецептором.
Модифицированный гормон роста связывается только со «своим» рецептором. Полученные результаты представляют несомненный интерес, но смогут ли модифицированные ГРЧ найти применение в клинике, пока неясно.
Терапия муковисцидоза. Неизлечимым наследственным заболеванием человека является муковисцидоз. Такие пациенты страдают инфекционными заболеваниями, поражающими легкие. Лечение рецидивирующих инфекций антибиотиками приводит к появлению резистентных штаммов патогенных бактерий. Бактерии и продукты их лизиса вызывают накопление в легких вязкой слизи, затрудняющей дыхание. Одним из компонентов слизи является высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных клеток при лизисе. Ученые выделили и экспреccировали ген ДНКазы — фермента, который расщепляет высокомолекулярную ДНК на более короткие фрагменты. Очищенный фермент вводят в составе аэрозоля в легкие больных муковисцидозом, он расщепляет ДНК, вязкость слизи снижается, что облегчает дыхание и улучшает состояние больного.
Другой препарат, помогающий таким больным — альгинат-лиаза. Альгинат
— это полисахарид, синтезируемый бактериями. Его мономерами являются бета-D-маннуронат и альфа-1-гулуронат, относительное содержание и распределение которых определяют свойства альгината. Так, остатки a-L- гулуроната образуют межцепочечные и внутрицепочечные сшивки путем связывания ионов кальция; остатки бета-D-маннуроната связывают ионы других металлов. Альгинат, содержащий такие сшивки, образует эластичный гель, вязкость которого пропорциональна размеру полисахаридных молекул. Выделение альгината слизистыми штаммами Pseudomonas aeruginosa существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцидозом. Чтобы очистить дыхательные пути и облегчить состояние больных, в дополнение к обработке ДНКазой следует провести деполимеризацию альгината с помощью альгинат-лиазы. Ген альгинат-лиазы был выделен из Flavobacterium sp., грамотрицательной почвенной бактерии, активно вырабатывающей этот фермент. На основе E.coli был создан банк клонов Flavobacterium и проведен
скрининг тех из них, которые синтезируют альгинат-лиазу, расщепляющую альгинат бактерий. Для получения фермента соответствующий ген клонировали в плазмидный вектор бацилл с сигнальным пептидом альфа- амилазы B.subtilis. Рекомбинантные клетки выделяли альгинат-лиазу в культуральную жидкость. Тестирование показало, что фермент способен эффективно разжижать альгинаты, синтезируемые слизистыми штаммами P.aeruginosa, которые были выделены из легких больных муковисцидозом.
 |
Производство антител. Молекула антитела, иммуноглобулин, состоит из: двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые соединены водородными связями и дисульфидными мостиками (рис. 21).
Рис. 21. Структура иммуноглобина (https://en.goldenmap.com/Antibody/).
Обе цепи иммуноглобулина, Н и L, содержат вариабельные (VH и VL) области на N-концах, причем, N концевые участки обеих L- и Н-цепей образуют антигенсвязывающую область антитела, для которой характерна очень высокая изменчивость последовательности аминокислот. Помимо вариабельных (VH и VL), каждая L-цепь содержит одну константную область, или домен (CL), а каждая Н-цепь — три константных области, или домена (СН1, СН2 и СН3). При обработке антитела протеолитическим ферментом папаином образуются три фрагмента: два идентичных (Fab), каждый из которых содержит L-цепь, связанную дисульфидным мостиком с VH- и СН1- доменами Н-цепи, и один Fc, состоящий из двух соединенных дисульфидной
связью СН2- и СН3-доменов Н-цепи. Fab-фрагмент, точнее его N-концевая часть, называемая Fv-фрагментом; обладает антигенсвязывающей активностью, специфичной для молекулы антитела.
Для использования антител в диагностике или терапии в качестве инструмента доставки лекарственных средств в участок локального функционирования (например, при тромбоэмболии мозговых и сердечных артерий) достаточно антигенсвязывающей области антител (Fv-фрагмента). Для производства рекомбинантных антител использовали бактерии E.coli. На мРНК лимфоцитов синтезировали кДНК, кодирующую Н- и L-цепи антител. Проводили расщепление кДНК рестриктазами, в результате которого образуется множество генных сегментов, кодирующих Н- и L-цепи антител. Сегменты клонировали в ДНК фага лямбда и получили фаговую библиотеку. Затем проводили объединение клонированных сегментов ДНК, кодирующих фрагменты Н- и L-цепей антител в одном плазмидном векторе. Скрининг библиотеки объединенных клонов осуществляли по антигенсвязывающей активности – оценивали полноценность Fv-области. Плазмиду с полноценной Fv-областью трансформировали в бактерии E.coli. Получали продукт, который используют в диагностике и терапии. Лекарственные вещества можно присоединить к Fv-фрагментам, например, специфичным в отношении опухолевых клеток. В перспективе разрабатывается получение комплекса белков, специфично связывающегося с ВИЧ-инфицированными клетками.
Антибиотики. Продукция антибиотиков микроорганизмами (грибы, актиномицеты и бактерии) является сложным процессом и определяется итоговой экспрессией генами биосинтеза и секреции в среду самого продукта, а также генами, отвечающими за антибиотикоустойчивость бактерий к этому продукту. Поэтому изменения отдельного гена в итоге не приводят к повышению выхода продукта. Высокую продуктивность, как правило, проявляют штаммы, устойчивые к действию высоких концентраций антибиотиков в культурной жидкости. Это свойство необходимо учитывать при конструировании суперпродуцентов. Большой эффект здесь дает технология
рекомбинантных ДНК. С ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Также генно-инженерные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства.
Биосинтеза антибиотика может включать от 10 до 30 стадий, так что поиск в геноме и клонирование всех генов биосинтеза – это сложная задача. Воссоздать полный кластер генов биосинтеза антибиотика можно путем сравнительного наложения геномов бактерий дикого типа, продуцирующих этот продукт с геномом мутантных штаммов, полностью утративших эту способность. С помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Манипулируя генами одного пути биосинтеза можно добиться увеличения выхода конечного продукта. Этот подход использовался для выделения из Penicillium chrysogenum гена синтетазы изопенициллина N, которая катализирует окислительную конденсацию 5-аминоадипил-цистеинил-Р-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов.
Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генно-инженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. При объединении в одном микроорганизме различных путей биосинтеза добиваются, чтобы промежуточный продукт одного пути биосинтеза служил субстратом для фермента другого пути биосинтеза. В одном из первых экспериментов был получен новый антибиотик путем объединении в одном микроорганизме двух различающихся путей биосинтеза. Эти данные показали, что когда будут детально изучены различные пути биосинтеза антибиотиков, появится
возможность создавать новые уникальные высокоспецифичные антибиотики, манипулируя генами, которые кодируют соответствующие ферменты.
Вакцины. Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать новое поколение вакцин. Введение вакцины вызывает формирование антител, которые при последующей инфекции патогеном приводят к его инактивации, блокируют пролиферацию и не позволяют развитие заболевания.
Аттенуированные вакцины. Современные вакцины создают на основе инактивированных патогенных микроорганизмов, либо живых, но невирулентных (аттенуированных) штаммов. Патогенные микроорганизмы модифицируют путем удаления из генома генов, ответственных за вирулентность, при этом способность вызывать иммунный ответ сохраняется. Примером такой вакцины служит противохолерная вакцина, созданная на основе штаммов Vibrio cholerae, из хромосомной ДНК которых делетирован ген энтеротоксина. Такие модифицированные микроорганизмы используют в качестве живой вакцины. Другой способ получения вакцин заключается в том, что из хромосомной ДНК патогена удаляют гены, кодирующие жизненно важные функции, например, гены pur, кодирующие ферменты биосинтеза пуринов, либо гены aro, ответственные за биосинтез ароматических соединений. Такие штаммы не способны пролиферировать, вызывают легкую форму инфекции и стойкий иммунитет. Таким путем была создана вакцина против сальмонеллеза на основе бактерий рода Salmonella.
Пептидные (субъединичные) вакцины. Для выработки в организме-хозяине антител в ответ на инфекцию достаточно присутствие только очищенных поверхностных белков. Такие вакцины содержат фрагмент патогенного организма, для их разработки также используют технологию рекомбинантных ДНК. Достоинства таких вакцин в безопасности, в ней отсутствуют дополнительные и нуклеиновые кислоты, которые могут оказать нежелательные побочные эффекты. Однако очистка специфического белка, способного вызывать иммунитет, стоит дорого, а конформация конечного продукта очистки может отличаться от исходной и приводить к изменению его
антигенных свойств. Субъединичные вакцины разрабатываются на основевирусов гриппа А и В, вирусов гепатита А и В, вируса бешенства, вируса герписа, вируса геморрагической лихорадки, микобактерий, сальмонелл, нессерий, шигелл, холерного вибриона и др. Примером может служить пептидная вакцина к вирусу гепатита В. Она создана на фрагменте белка внешней оболочки вируса размером до 200. Оказалось, что пептид обладает такой же иммунногенностью как интактный вирус гепатита В и может быть использован для формирования иммунного ответа. Ген, кодирующий оболочечный белок вируса, встраивают в вектор экспрессии и получают высокоуровневую продукцию белка, который используют как вакцину. Другой пример с противотуберкулезной вакциной БЦЖ (Бацилла Кальметта—Герена или Bacillus Calmette—Guérin, BCG). Вакцины на основе живых ослабленных форм, способны вызвать заболевание у людей со слабым иммунотетом, например у больных СПИДом. Микобактерии секретируют в среду около ста белков. Шесть из них являются доминирующими, а их комбинация дает устойчивый иммунитет. На этой основе разработали безопасную и эффективную вакцину для профилактики туберкулеза у человека. Гены соответствующих белков микобактерий туберкулеза клонированы в вектора экспрессии, которые трансформированы в бактерии E.coli, продукты экспрессии используются в качестве вакцины.
В настоящее время интенсивно разрабатываются вакцины из плазмидных ДНК, кодирующих антигены возбудителей инфекционных заболеваний. Идея таких вакцин состоит в том, чтобы встроить гены микроорганизма, ответственные за синтез микробного белка, в геном хозяина. При этом клетки организма-хозяина начинают продукцию чужеродного для них белка, а иммунная система вырабатывает антитела к нему. Эти антитела и будут нейтрализовать возбудителя в случае попадания его в организм. Плазмиду, несущую ген белка-антигена вводят внутримышечно животным. В 75% случаев плазмида включалась в клетки мыши и синтезировались антитела к белку антигену. В опытах на животных было показано, что таким путем можно
выработать не только антитела (гуморальный иммунитет), но и специфический цитотоксичный ответ (клеточный иммунитет), который ранее считался достижимым только с помощью живых вакцин. ДНК-вакцины могут быть получены в большом количестве, они стабильны и лишены инфекционности. Перспективным направлением является разработка многокомпонентных вакцин, содержащих две или несколько плазмидных форм, которые кодируют разные антигены, цитокины или другие биологически активные молекулы. К настоящему времени на животных изучено более 40 вирусных, бактериальный, грибковых и паразитарных возбудителей вакцин (в том числе против вируса СПИД, гриппа, бешенства, лимфоцитарного хориоменингита, гепатитов В и С, простого герпеса, папилломы, а также возбудителей малярии, лейшманиоза, туберкулёза). Однако, в опытах на добровольцах до сих пор удовлетворительного иммунного ответа получено не было. Также, при использовании ДНК-вакцин существует несколько неясных моментов: неизвестны сроки, в течение которых клетки организма будут вырабатывать антигенный белок далеко не все ясно с безопасностью ДНК-вакцин: необходимо исключить онкогенную опасность. Еще недостаточно изучено, может ли вводимая ДНК встраиваться в геном клетки человека и вызывать риск развития рака. Образование антигена в организме может продолжаться длительное время (до нескольких месяцев), это может привести к развитию различных форм иммуносупрессии и других патологических явлений. Чужеродная ДНК может вызвать образование анти-ДНК-антител, которые способны индуцировать различные формы аутоагрессии и иммунопатологии. Сам образующийся антиген может обладать побочным биологическим действием.
Растительные вакцины. Революционным направлением является разработка вакцин на основе трансгенных растений, в геном которых был встроен соответствующий фрагмент генома патогенного микроорганизма. Данные свидетельствуют о безусловной перспективе в разработке и практическом использовании таких вакцин. Такой способ иммунизации
является безопасным и доступным. Немаловажное значение имеет высокая экономичность растительных вакцин с учетом, что по прогнозам многих специалистов стоимость существующих генно-инженерных вакцин будет возрастать, а цена многих вновь разрабатываемых вакцин будет выше стоимости применяемых в практике вакцин.
Первая растительная вакцина получена в 1992 году: трансгенное растение табака стало продуцировать антиген, введение которого мышам, вызывало мощный иммунный. В 1998 году с помощью картофеля, продуцирующего В- субъединицу холерного анатоксина, была получена выраженная защита у поедавших его мышей при заражении их холерой. Аналогичная вакцина против кори была получена на табаке. В том же 1998 году 10 из 11 добровольцев, получивших по 100 гр сырого картофеля, продуцирующего антигены энтеропатогенной кишечной палочки, начали вырабатывать в слизистой кишечника антитела к этому возбудителю. Сейчас испытываются "картофельные" вакцины к вирусу -возбудителю диареи и гепатиту В с обнадеживающими результатами. На животных испытываются вакцины против бешенства, выращенные на помидорах. Существуют опасения в отношении "съедобных вакцин": в отношении иммунного ответа, сохранности антигена в кислой среде желудка, способности к хранению, оптимальном дозировании.
Векторные вакцины получают путем встраивания в геном безопасного авирулентного вируса ген(ы), кодирующие антигенные детерминанты патогена. Модифицированный вирус используют как живую вирусную вакцину. Клетки, в которых векторный вирус реплицируется in vivo, экспрессируют чужеродный белок, вызывающий иммунный ответ на данный белок. Вирус оспы был одним из первых вирусов, на примере которого была показана возможность такой замены без потери жизнеспособности рекомбинантного вируса с экспрессией белка, кодируемого чужеродным геном и индукцией иммунитета на этот белок. Подход к получению безопасной эффективной живой вакцины заключается в использовании стабильного вирусного штамма для создания рекомбинантов, которые экспрессируют антигены других вирусов, против которых
формируется иммунитет. Члены семейства вирусов оспы оказались удобными для получения рекомбинантных гибридов, благодаря их большому геному, позволяющему удалять значительные участки ДНК без потери способности к репликации. Использование этого вируса в качестве вектора для вакцинации имеет ряд преимуществ: способность размножаться в клетках многих видов животных, экспрессировать несколько генов, индуцировать гуморальный и опосредованный клетками иммунитет, термостабильность, экономичность производства и легкость применения. Гены, кодирующие различные антигены многих вирусов, были включены в геном вируса осповакцины. Прививка животных этими рекомбинантными векторными вакцинами сопровождалась хорошим иммунным ответом. Например, вирус осповакцины, использованный в качестве вектора вакцины против бешенства, будучи включенным в приманку для скармливания, защищал лис и хорьков от бешенства. Возможность включения нескольких генов, кодирующих соответствующие иммуногены, позволяет создать новый тип комбинированных (поливалентных) вакцин.
Потенциальными векторами являются многие ДНК-содержащие вирусы: могут быть использованы адено-, бакуло- и герпесвирусы. Они, как и вирусы оспы, имеют крупный геном, - по крайней мере с одной несущественной областью для репликации и несколькими участками, в которые могут быть встроены чужеродные гены и экспрессированы без потери инфекционности. В качестве векторов успешно используют вирусы оспы птиц. Основное различие векторных вакцин с живыми вакцинами заключается в том, что экспрессируется только один или несколько селективных генов, реплицируемых вместе с геномом вектора. В этом отношении, векторные вакцины схожи с субъединичными вакцинами, но отличаются от них тем, что являются «реплицирующимися антигенами». Рекомбинантные векторные вакцины сочетают в себе положительные качества и живых и инактивированных вакцин. При репликации в организме рекомбинантного вируса с встроенным чужеродным геном, кодирующим синтез гликопротеина, который может быть экспрессирован на поверхности клеток и может
индуцировать развитие как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Субъединичные вакцины могут индуцировать развитие только гуморального иммунного ответа.
Использование генно-инженерных вакцин - новое перспективное направление в генной инженерии. В последнее время этот метод получил широкое применение в разработке нового поколения вакцин против различных вирусных заболеваний. Естественно, что становление принципиально нового направления создания вакцин сопряжено со многими трудностями. Однако на главный и принципиальный вопрос - способны ли рекомбинантные вакцины вызывать выраженный и длительный иммунитет - получен положительный ответ. Накопилось также много данных о получении рекомбинантных вакцин, особенно на основе вируса осповакцины, содержащих гены различных вирусов, об их антигенной и иммуногенной активности при испытании в лабораторных и практических условиях.
Получение бактериальных рестриктаз. Выделено более трех тысяч рестриктаз. Более шестисот рестриктаз доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения широкого ряда генно-инженерных задач. Рестриктазы с различными сайтами узнавания являются основным инструментом генетических исследований в генной инженерии и молекулярной биологии. Эти ферменты синтезируются разными микроорганизмами. Для получения рестриктаз их гены клонируют по универсальной методике:
1. ДНК бактерий расщепляют рестриктазой HindIII
2. Полученные фрагменты ДНК клонируют в плазмиде pBR322 после ее обработке рестриктазой HindIII
3. Рекомбинантные плазмиды трансформируют в клетки бактерий E. coli и инфицируют фагом лямбда
4. Если клетки устойчивы к действию фага, то в клетках содержится рестриктаза. Такие клетки лизируют и в лизатах определяют активность
5. Положительные рекомбинантные клоны используют для получения белка.
Именно этот подход использован для выделения генов различных бактериальных рестриктаз, имеющих в настоящее время коммерческую значимость.
Получение витамина С. На основе генно-инженерных методов можно получать микроорганизмы с новыми свойствами, например, с новой ферментативной активностью. В настоящее время для производства витаминов используют трудоемкие химические методы. Например, для получения витамина С используют несколько химических и одну микробиологическую стадию. Исходным сырьем является D-глюкоза, из которой в ряду реакций на последней стадии получают 2-кето-L-гулоновую кислоту (2-KLG), которая в кислых условиях превращается в L-аскорбиновую кислоту. Исследования метаболизма различных микроорганизмов показали, что 2-кето-L-гулоновую кислоту можно получить микробиологическим путем. Бактерии Acetobacter, Gluconobacter и Erwinia способны превращать D-глюкозу в 2,5-дикето-D- глюконовую кислоту (2,5-DKG), другие микроорганизмы Corynebacterium, Brevibacterium и Arthrobacter синтезируют редуктазу, которая способна преобразовывать 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту в 2-кето-L-гулоновую кислоту. Эти исследования показали, что если в одном микроорганизме объединить оба метаболических пути, то такие микроорганизмы будут способны превращать D-глюкозу в 2-кето-L-гулоновую кислоту. Совместное выращивание этих микроорганизмов невозможно в силу различий условий культивирования и свойств, что привело бы к спонтанному выводу из среды одного из них. Поэтому ген фермента 2,5-DKG редуктазы неспорулирующих почвенных бактерий Corynebacterium необходимо трансформировать в клетки Erwinia. Ген редуктазы Corynebacterium был клонирован в E. coli, а затем переклонирован в Erwinia herbicola. Рекомбинантные клетки Erwinia herbicola были способны к образованию из D-глюкозы непосредственно2-кето-L- гулоновую кислоты. Так с помощью техники рекомбинантных ДНК удалось объединить метаболические реакции разных микроорганизмов. Рекомбинантные бактерии способны были синтезировать конечный продукт
комбинированного метаболического пути и обрели коммерческую значимость. Выход конечного продукта можно увеличить повышением термостабильности и специфической активности рекомбинантной редуктазы.
Схемы путей получения витамина С. Химический путь получения витамина С:
D-глюкоза --- химические превращения --- 2-KLG --- понижение рН --- L- аскорбиновая кислота
Микробиологический путь получения витамина С:
1. D-глюкоза --- 2,5-DKG (синтезируют микроорганизмы Erwinia, Acetobacter, Gluconobacter)
2. 2,5-DKG --- 2-KLG (синтезируют микроорганизмы Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter)
Генно-инженерная технология для получения витамина С:
D-глюкоза --- 2,5-DKG --- 2-KLG рекомбинантный штамм Erwinia herbicola с геном 2,5-DKG редуктазы Corynebacterium
Получение аминокислот. Потребность в аминокислотах во всех сферах деятельности людей крайне велика. В промышленном масштабе их получают экстракцией белковых гидролизатов, а также как продукты метаболизма двух неспорулирующих грамположительных почвенных бактерий Corynebacterium и Brevibacterium. Для увеличения продуктивности микроорганизмов используют генно-инженерный подход. Он заключается в изменении специфичности продуктов генов, участвующих в ключевых реакциях биосинтеза аминокислот. Ферменты биосинтеза аминокислот ингибируются конечным продуктом. Модификация соответствующих генов в направлении приобретения устойчивости к ингибированию конечным продуктом (ингибирование по типу обратной связи) может привести к увеличению выхода конечного продукта. Большинство плазмидных векторов реплицируются в грамотрицательных бактериях, поэтому для реализации этой задачи необходимо создать векторы, предназначенные для экспрессии в Corynebacterium и Brevibacterium. На этом пути получены положительные результаты в увеличении выхода триптофана
Corynebacterium glutamicum. При трансформации штамма-продуцента вектором, содержащим ген, кодирующим один из ферментов синтеза триптофана (антранилатсинтазу) выход триптофана увеличился в 2.5 раза за счет дополнительных копий гена фермента синтеза. Еще более высокий уровень синтеза триптофана достигался при введении в клетки C.glutamicum генов трех ключевых модифицированных ферментов синтеза триптофана. В гены соответствующих белков были введены мутации, которые обеспечивали нечувствительность к ингибированию конечным продуктом.
Биодеградация токсических соединений. Проблема утилизации токсических отходов стоит очень остро. Основную группу почвенных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, составляют бактерии рода Pseudomonas. Разные штаммы способны расщеплять более 100 органических соединений. Гены, кодирующие ферменты биодеградации, могут иметь хромосомную и плазмидную локализацию, но чаще входят в состав крупных плазмид. Как правило, одна плазмида содержит гены ферментов только одного пути расщепления. В основе создания новых рекомбинантных штаммов заложены два принципа. Во-первых, объединяя плазмиды разных штаммов в одном хозяине, можно получить организм, способных к расщеплению нескольких соединений. Во-вторых, создание новых штаммов может основываться на манипуляции с генами одного или нескольких путей расщепления. Первый подход был реализован для получения штамма с широкими катаболическими возможностями. Вторая стратегия направлена на усовершенствование пути расщепления ксенобиотиков. Ферменты метаболического пути модифицируются по пути устойчивости к ингибированию конечным продуктом.
Микробные инсектициды. Огромный ущерб урожаю могут наносить насекомые. Для борьбы с ними получают все большее признание природные микробные инсектициды, т.к. не оказывают вредного воздействия на человека и быстро разрушаются в окружающей среде. Для увеличения эффективности микробных инсектицидов можно проводить манипуляции с их генами, и в
частности, с генами инсектицидов спорообразующих почвенных бактерий B.thuringiensis или бакуловирусов насекомых. Эти инсектициды безопасны, высоко специфичны и эффективны. Наиболее изученными и часто используемыми инсектицидами являются бактерии B.thuringiensis. Они представлены множеством штаммов, каждый из которых синтезирует токсин, специфичный в отношении определенных видов насекомых. Инсектицид или белковый токсин образуется в клетках бактерий во время споруляции и представляет собой параспоральную кристаллическую структуру, на долю которой приходится до 30% от сухой массы спорулирующих клеток. Все токсины B.thuringiensis можно разделить на четыре основных класса, каждый класс на подклассы и далее на подгруппы согласно последовательностям аминокислот соответствующих токсинов. Гены многих из них клонированы. В клетках бацилл токсины находятся в виде неактивных протоксинов. После заглатывания насекомым протоксин активируется в кишечнике под действием протеиназ в активный токсин, который встраивается в мембрану эпителия кишечника насекомого и образует канал, через который происходит утечка АТФ. Через 15 мин клеточный метаболизм таких насекомых блокируется, насекомое перестает питаться и погибает. Генная инженерия генов токсинов ба<