КАЗАНСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
М.Р.ШАРИПОВА
КУРС ЛЕКЦИЙ ПО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Учебное пособие
Казань 2015
Печатается по решению Учебно-методической комиссии Института Фундаментальной Медицины и Биологии КФУ
Протокол № 1 от 9.09.14
УДК 579.6 ББК28.4
Автор:
д.б.н., проф. М.Р.Шарипова
Рецензенты:
Д.б.н., проф. кафедры биохимии и биотехнологии К(П)ФУ Т.В.Багаева
К.б.н., доцент каф.микробиологии Казанской государственной медицинской
академии Л.В.Кипенская
Курс лекций по генетической инженерии: учебное пособие / М.Р.Шарипова. – Казань: К(П)ФУ, 2015. -114с.
Учебное пособие основано на материале, который используется для чтения курса лекций по генетической инженерии студентам, обучающимся по биологическим специальностям. Изложены стратегия молекулярного клонирования, типы молекулярных векторов, современные методы получения рекомбинантных ДНК, амплификации и секвенирования. Большое внимание уделено практическому применению достижений генной инженерии для получения лекарственных средств, вакцин, инсектицидов, генной терапии, получению трансгенных растений и животных.
Учебное пособие может использоваться в учебном процессе, а также быть полезным для тех, кто хочет специализироваться в области генной инженерии.
© Шарипова М.Р., 2015
Содержание
| Введение | |
| Стратегия молекулярного клонирования | |
| Типы молекулярных векторов | |
| Векторные молекулы ДНК | |
| Характеристика хозяев для векторов с чужеродной ДНК | |
| Клонирование структурных генов эукариот Блоттинги | |
| Секвенирование ДНК | |
| Система полимеразной цепной реакции | |
| Направленный мутагенез молекул ДНК in vitro | |
| Геномы микроорганизмов | |
| Генетическая инженерия дрожжей | |
| Генетическая инженерия бактерий | |
| Генетическая инженерия бактерий | |
| Генетическая инженерия животных | |
| Генетическая инженерия человека | |
| Основная литература |
Введение
Генная инженерия относится к новому разделу экспериментальной молекулярной биологии и направлена на конструирование in vitro функционально-активных генетических структур - рекомбинантных ДНК. Появление новой методологии расширило экспериментальные границы молекулярной биологии, поскольку позволило манипулировать с чужеродной ДНК и исследовать ее функционирование в гетерологичных системах. Такой подход обогатил теорию знаниями о закономерностях механизма передачи генетической информации и послужил основой для создания принципиально новых биотехнологий. По сути, генно-инженерные методы совершили революцию в биологической науке.
Цель генной инженерии – выяснение механизмов функционирования генетического аппарата. Практические задачи - создание генно-инженерных штаммов бактерий для получения лекарственных средств, диагностикумов, вакцин; создание трансгенных растений с заданными свойствами; создание трансгенных животных для практических целей; разработка методов генной терапии человека.
Фундаментом для развития генной инженерии служат достижения в молекулярной биологии, микробиологии, биохимии и генетике. Достижения в этих базисных областях науки позволили изолировать дискретные участки ДНК
– гены. До создания методологии рекомбинантных ДНК все рассуждения о природе гена, генетическом коде были теоретическими. Можно было выделить ДНК практически из любых организмов, но невозможно было выделить отдельный ген. Гены идентифицировали наблюдением за корреляцией специфических мутаций (наблюдение фенотипа).
Технология получения рекомбинантной ДНК позволила впервые в практике научных исследований выделить из организма индивидуальный ген. Это стало точкой отсчета для развития науки генной инженерии.
Почему изолировать ген так важно? Выделение гена дает возможность исследовать его структуру, выяснить закономерности организации и строения,
сравнить с другими генами и определить последовательность аминокислот белка, который этот ген кодирует. Знание белкового продукта позволяет сделать заключение о функции гена. И, наконец, знание структуры гена дает возможность его целенаправленной модификации.
Теоретические предпосылки для генной инженерии:
1. К началу развития науки генной инженерии был установлен механизм информационного взаимодействия между основными макромолекулами, участвующими в передаче наследственной информации от одного организма другому. Это – репликация, матричный синтез ДНК, при котором цепочка ДНК расплетается, и на каждой образуются новые, комплиментарные. По такому же механизму на ДНК синтезируются комплиментарные ей РНК – транскрипция. На матрице РНК на рибосомах осуществляется синтез белка, структура которого соответствует структуре мРНК – трансляция.
2. Следующий шаг на пути к генной инженерии – открытие внехромосомной самореплицирующейся ДНК или мини-хромосом, которые получили название плазмиды.
3. Выделение и получение ферментов рестриктаз, которые специфически расщепляют ДНК, позволило манипулировать с фрагментами ДНК и привело к возможности изолировать индивидуальный ген.
Приемы генной инженерии позволяют проводить рекомбинацию ДНК in vitro и только затем вводить целевую конструкцию в клетку, где происходит экспрессия гена.
История молекулярного клонирования начинается в 1972 г, когда впервые in vitro была получена рекомбинантная молекула ДНК из фрагментов разных ДНК. Вирусная ДНК SV40 и ДНК фага лямбда были объединены в лаборатории П.Берга (Станфордский университет, США). В 1973 г. Коэн и Бойер использовали для получения рекомбинантной ДНК плазмидную ДНК и получили первую гибридную плазмиду, которую можно ввести в бактериальные клетки и получить экспрессию чужеродной ДНК in vivo. Стало очевидным, что новый метод открывает неограниченные возможности. Далее
следует 35-летняя истории развития науки о молекулярном клонировании. В итоге, осуществлен прорыв в понимании структуры гена, получены качественно новые знания об организации наследственной информации. К ним можно отнести открытие мозаичного строения генов эукариот в отличие от генов прокариот, идентификацию мобильных элементов, разработку информационных технологий, создание мировых баз данных для анализа и сравнения генов. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Впечатляющие успехи генной инженерии в практических достижениях. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробных продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены.
Стратегия молекулярного клонирования
Универсального метода получения рекомбинантной ДНК не существует.
Принцип метода соответствует схеме (Рис. 1):
- получают фрагменты ДНК из организма донора, которые могут содержать от одного до нескольких генов;
- каждый из фрагментов лигируют с векторной ДНК с образованием рекомбинантной молекулы, векторная ДНК несет маркер устойчивости к антибиотику;
- смесь рекомбинантных ДНК используют для трансформации в клетки- реципиенты, где плазмида реплицируется и передается потомству;
- рекомбинантные клетки отбирают на селективных средах;
- если рекомбинантные клетки продуцируют белок, идентичный донорной ДНК, это является подтверждением молекулярного клонирования.
Таким образом, стратегия молекулярного клонирования заключается в том, чтобы изолировать индивидуальный ген или гены из большого и сложного генома и «переселить» его (их) в маленький и очень простой геном.
Для клонирования генов может служить геномная ДНК, кДНК, которая синтезируется с помощью обратной транскриптазы на матрице РНК, амплифицированная ДНК, полученная с помощью полимеразной цепной реакции, а также синтетическая ДНК, синтезированная in vitro из нуклеотидов.
Рис. 1. Общая стратегия молекулярного клонирования [https://www.ncbi.nih.gov/book/ Modern Genetic Analysis/recombinant DNA technology]
Если в качестве исходной ДНК используется геномная ДНК, то сначала проводят клонирование случайных участков ДНК (Shotgun-клонирование). Когда на одном из больших фрагментов обнаружен ген, проводят субклонирование, т.е. расщепляют фрагмент мелкощепящими рестриктазами.
Присоединение ДНК к клонирующему вектору проводят с помощью ДНК- лигазы. Векторы последнего поколения содержат мультиклонирующий сайт (полилинкер) – сегмент ДНК, содержащий различные сайты рестрикции (обычно они перекрываются друг с другом).
Процесс введения рекомбинантных векторов в клетки-хозяева называется трансфекцией. Трансфекция может осуществляться несколькими способами в зависимости от природы вектора: трансформацией, коньюгацией и трансдукцией гетерологичной ДНК.
Трансформация – способность бактериальной клетки поглощать молекулы ДНК из раствора. Выход транформантов низкий и составляет 10-5, зависит от штамма, размера ДНК и условий эксперимента. Существует несколько способов для увеличения эффективности трансформации. Клетки подвергают температурному воздействию и обрабатывают раствором СаСl2. В результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки, что облегчает проникновение ДНК в клетку. Такая обработка дает максимальную частоту трансформации, примерно 10-3. Такой же эффект достигается при использовании для трансформации протопластов и сферопластов, в результате чего мембрана становится более доступной. К увеличению частоты трансформации приводит также обработка клеток полиэтиленгликолем в результате частичного повреждения цитоплазматической мембраны. Для увеличения частоты трансформации используют физический метод – электропорацию, что приводит к увеличению мембранной проницаемости. Смесь клеток и ДНК подвергают электрическому разряду 2-4 тыс в, при этом в мембране образуются каналы и через них внутрь клетки проникает ДНК. Клоны, несущие рекомбинантные плазмиды, легко отобрать за счет идеального селективного маркера – антибиотикоустойчивости.
Коньюгация – перенос ДНК из клетки-донора в клетку-реципиент. Большинство плазмид, которые используются в работе с рекомбинантными ДНК, не коньюгативные и не способны самостоятельно переходить в клетки
путем коньюгации. Поэтому их вводят в клетки вместе с коньюгативными плазмидами, предназначенными для переноса по механизму мобилизации.
Трансдукция – инъекция ДНК бактериофага в бактериальную клетку. В процессе инфекции бактериофаги адсорбируются на поверхности клетки и проникают в нее с частотой близкой 100% в отличие от низкоэффективной трансформации. Таким образом, если in vitro упаковать рекомбинантную ДНК в головки фага, то можно ожидать ее эффективный перенос в клетку хозяина.
Хранение. Первичное клонирование ДНК обычно дает набор клонов, соответствующих полному геному. Такая смесь клонов, полученных в результате расщепления индивидуального генома, называется ДНК- библиотекой или библиотекой генов. ДНК может храниться в виде клонов на векторах, каждый из которых при необходимости может быть востребован.
Идентификация клона. Процедура направлена на поиск необходимого клона в смеси, иногда из тысяч клонированных фрагментов. Эта задача сложная, но существующая техника позволяет успешно провести идентификацию даже в случае очень больших геномов (иммунологический скрининг, пульс- электрофорез, ДНК-гибридизация, ДНК-микрочипы, скрининг по активности белка).
После клонирования ДНК ее секвенируют, проводят поиск открытой рамки считывания, затем конвертируют последовательность нуклеотидов в белковый продукт, при необходимости проводят сайт-специфический мутагенез и изучают продукты экспрессии. Если сиквенс показал, что клон содержит неполную рамку считывания, то процедуру клонирования повторяют, применяя другую рестриктазу для расщепления исходной ДНК.