Исследования по генетической инженерии человека значительно интенсифицировались в ходе выполнения программы «Геном человека». Цель проекта секвенировать нуклеотидные последовательности ДНК хромосом человека. Проект завершен в 2002 г., составлена полная карта генома человека и в настоящее время идут исследования по локализации в ней всех генов. Идентифицированы многие гены, контролирующие развитие заболеваний или предрасполагающих к ним. Выявлены гены, ответственные за высокое артериальное давление, меланому, регуляцию роста, артрит, рак груди,
сердечно-сосудистые заболевания, болезнь Паркинсона, установлена генетическая основа некоторых психических заболеваний, таких как аутизм, аффективные расстройства, шизофрения и другие. Таким образом, практический потенциал программы «Геном человека» нацелен на биомедицинские исследования.
Генодиагностика – это выявление генов, ответственных за заболевания человека. Их идентификация позволит поставить точный диагноз и выбрать путь лечения, провести раннюю диагностику, выявить предрасположенность к ряду соматических и психических заболеваний и принять соответствующие профилактические меры. Для генодиагностики проводят исследование белка, например, гемоглобина или альфа1-антитрипсина (масс-спектрометрия и двумерный электрофорез), РНК (ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени) или ДНК (чипы, гибридизация, ПЦР и блоты). Основной приоритетный метод – это исследование ДНК. ДНК-диагностику в настоящее время применяют в медицинской практике для выявления мутаций при наследственных, а также приобретенных заболеваниях и при ДНК-типирования организмов (табл. 3).
Таблица 3. Применение ДНК-диагностики в медицине https://humbio.ru/humbio/genexp/001b28d7.htm)
Эта методология в основном применима для обнаружения моногенных заболеваний. Ее проведение при полигенных, а иногда мультифакториальных болезнях, обусловленных многочисленными генами и ненаследственными факторами, пока затруднена. Их исследования проводят на более простых моделях (дрозофилы и трансгенные мыши).
Методы ДНК-диагностики основаны на том, что короткие олигонуклеотиды (зонды или праймеры), при добавлении в пробы в процессе ренатурации нуклеиновых кислот благодаря комплементарным взаимодействиям соединяются с тем участком нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую последовательности нуклеотидов зонда или праймера (Рис. 25).
 |
Рис. 25. ДНК-диагностика путем гибридизации меченых зондов (праймеров) с гомологичными участками ДНК. Звездочками отмечены метки (радиоактивная, флуоресцентная или другая) в олигонуклеотидных зондах или праймерах https://humbio.ru/humbio/genexp/001b27c7.htm
Уже сейчас на основе достижений программы "Геном человека" и с помощью рекомбинантных ДНК, ПЦР, современных методов анализа ДНК можно многое узнать о строении определенных локусов генома человека. По
мере того как генодиагностика становится все более доступной, ее будут
внедрять в практику, а результаты заносить в медицинскую карту, как это делается с другими сведениями о больном, например с результатами измерения АД, сывороточной концентрации холестерина или гемоглобина. Для проведения ДНК-диагностики необходимо провести анализы с целью обнаружения в геноме больного известных или новых мутаций, ассоциированных с развитием мутантного фенотипа в виде симптомов конкретного заболевания.
Со стремительным развитием и удешевлением ДНК-технологий, а также созданием новых банков генетической информации о различных группах населения, возникает опасность ее неправомерного использования, что может привести к различным видам дискриминации. Поэтому для масштабного внедрения новых технологий ДНК-диагностики параллельно необходимо развитие правовых норм, призванных законодательно закрепить требования к проведению генетических экспертиз и использованию генных технологий, соответствующие главным этическим принципам и нормам современной биомедицины.
Генная терапия представляет собой новый метод лечения, основанный на замене гена, ответственного за заболевание, «здоровым» геном. Целью генной терапии является «исправление» деятельности генов, которые вызывают или способствуют развитию конкретных заболеваний или патологических состояний. Генная терапия осуществляется в двух формах: соматическая генная терапия и генная терапия зародышевых клеток. Соматическая генная терапия - это коррекция заболевания путем введения в клетку-мишень функционально- активного гена, в результате приобретенные свойства проявляются на клеточном уровне и не передаются по наследству. Этот вид терапии разрешен во всех странах мира, владеющих этой технологией. Генная терапия зародышевой линии предполагает вмешательство в генетический аппарат эмбриона на различных стадиях его развития. Этот вид генной терапии запрещен к применению и находится на стадии научных исследований и разработок.
До сих пор лечение генетических заболеваний человека проводили путем введения недостающего белкового продукта. Процедура требует многократного повторения, и, как правило, является дорогой и продолжительной процедурой, ведущей к постепенному ослаблению организма. Нужны принципиально новые виды терапии. Сегодня разработаны две основные стратегии генной терапии: ex vivo и in vivo (Рис. 26).
 |
Рис. 26. Основные стратегии генной терапии ex vivo и in vivo (пояснения в тексте). А - получение ex vivo трансгенных стволовых кроветворных клеток с помощью ретровирусного вектора, LTR (l ong t erminal r epeat) - длинный концевой повтор вирусного генома. Б - методы in vivo: аэрозольная ингаляция при муковисцидозе и парентеральная инъекция для целенаправленной доставки в печень или мышцы генов в составе различных векторов и других систем доставки. https://www.medbiol.ru/medbiol/
Генная терапия ex vivo (А) включает: получение от пациента клеток с геннымдефектом, культивирование изолированных клеток, трансфекция генной терапевтической конструкции в изолированные клетки с помощью ретровирусного вектора, выращивание и отбор трансфецированных клеток, трансплантация (трансфузия) трансфецированных клеток пациенту. Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после трансплантации у него не разовьется иммунный ответ. Такой метод применяется при трансплантации клеток костного мозга. Это связано с наличием в нем стволовых клеток, которые способны пролиферировать и
дифференцироваться в различные типы клеток (лимфоциты, макрофаги, эритроциты, тромбоциты и др.).
Генная терапия in vivo (Б) представляет собой доставку терапевтического гена непосредственно в клетки. Для доставки применяются вирусные системы, прежде всего ретровирусы. Рекомбинантные ретровирусы проникают только в активно делящиеся клетки-мишени и способны включатся в геном клетки- хозяина, из их генома удаляют гены, ответственные за их размножение, однако введенный вектором новый ген передается дочерним клеткам при клеточном делении. Клетки многих тканей, на которые направлена генная терапия, не делятся. В связи с чем, разработаны векторные системы доставки терапевтических генов, учитывая разнообразие потенциальных тканей- мишеней (кожа, мышца, легкие, мозг, толстая кишка, селезенка, печень, клетки крови). Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки и позволяют вводить гены в клетки нервной системы и эпителий дыхательных путей. Аденовирусы используются также как живые вакцины, предотвращающие респираторные инфекции, гастроэнтериты. Используют аденоассоциированные вирусы, для продуктивной инфекции которых нужны вирусы помощники – аденовирусы. В качестве вектора генов используют вирус герпеса, который способен переносить гены в клетки печени, направленно инфицирует нейроны, существует в них в латентной форме, а литический цикл вирусов инициируется при стрессе. Вирус герпеса подвергается генно-инженерной обработке, ведущей к утрате способности к размножению. Испытываются в качестве векторов ДНК парвовирусы. С помощью вирусных векторов терапевтический ген, кодирующий белок, устраняющий дефект, доставляется в клетки определенной ткани и экспрессируется в них. Экспрессия осуществляется под контролем тканеспецифичного промотора.
Наряду с вирусными применяют невирусные системы доставки. Во- первых, это прямое введение терапевтической ДНК-конструкции в клетки- мишени. Разработана технология микроинъекций ДНК в клетки (миоциты). Ограничение такого способа доставки заключается в том, что далеко не все
ткани доступны для такой инъекции. Для трансфекции трансгена используют липосомы, а именно, создают вокруг терапевтической конструкции искусственную липидную оболочку для облегчения проникновения ее через мембрану. Следующий путь доставки это конъюгаты ДНК с трансферрином или асиалогликопротеином, для которых на многих клетках имеются рецепторы (лиганд-рецепторный принцип). После связывания с рецептором конъюганты ДНК поглощаются клеткой, хотя вероятность встраивания введенной ДНК в геном хозяина очень невелика. Все же такой ген может временно выполнять свои функции. Большой потенциал для генной терапии представляют искусственные хромосомы человека (HAC-системы экспрессии). Необходимо разработать способы доставки этих векторов в клетки и способы контроля их целевой экспрессии.
В целом, обе стратегии ex vivo и in vivo, основаны на использовании для терапии генетической конструкции, которая восстанавливает функцию гена. Однако многие заболевания человека связаны с гиперпродукцией генов (онкологические заболевания, воспаления, вирусные инфекции). Возникает необходимость подавить функцию гена, т. е. ингибировать его экспрессию. Для этой цели разработаны терапевтические системы на основе олигонуклеотидов. Антисмысловой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции и трансляции. Олигонуклеотид, который гибридизуется с геном и блокирует транскрипцию называют «антигенным». Олигонуклеотид, который гибридизуется с мРНК –
«антисмысловым». Снизить уровень экспрессии может также олигонуклеотид, который связывается с фактором транскрипции.
Перспективным направлением генной терапии при онкозаболеваниях и ВИЧ-инфекции является РНК-интерференция. Способность малых дцРНК подавлять на уровне трансляции экспрессию гомологичных генов является одной из приоритетных областей исследований в современной биомедицине. Эффективным способом доставки малых интерферирующих РНК (si-РНК) в клетки-мишени является использование векторных плазмидных конструкций,
содержащих ДНК, кодирующую si-РНК. При введения векторных конструкций в клетку происходит деградация мРНК-мишени, не образуется соответствующий ей белок, т.е. достигается целевой терапевтический эффект.
Установлено, что в ВИЧ-инфицированных клетках векторные конструкции, экспрессирующие вирусспецифичные si-РНК (соответствуют участкам генов pol, gag и области LTR в вирусном геноме и встроены в плазмидный вектор siSTRIKE™ U6, Hairpin Cloning Systems, Promega), вызывали подавление репродукции ВИЧ-1. Результаты свидетельствуют, что данный подход может быть использован в генной терапии ВИЧ-инфекции.
Терапия, основанная на РНК-интерференции включает:
1. Выбор гена-мишени. Несмотря на то, что эффективность si-РНК проверена в экспериментах на животных, перед внедрением техники РНК- интерференции в противораковую терапию необходима разработка метода на культуре раковых клеток человека. Первым шагом является выбор гена-мишени для РНК-интерференции. Генами-кандидатами могут быть онкогены, антиапоптотические гены, гены ангиогенных факторов, факторов роста или их рецепторов, а также специфические гены, связанные с развитием рака.
2. Создание si-РНК. После выбора гена-мишени с помощью компьютерных программ подбирают si-РНК для подавления целевого гена. Нет единого метода создания идеальной терапевтической последовательности si-РНК. Учитывается несколько параметров исходя из биохимии процесса РНК-интерференции и функций молекулы мРНК. В итоге, синтезируют si-РНК и оценивают уровень гибридизации с мРНК. В настоящее время биотехнологические компании Sigma, Dharmacon, QIAGEN и Ambion занимаются разработкой программного обеспечения для создания si-РНК, а также предоставляют услуги по синтезу специфических si-РНК.
3. Системы доставки si-РНК в клетки. Для доставки si-РНК используют электропорацию, плазмиды, содержащие дцРНК, вирусные вектора, содержащие
«кассеты» si-РНК. Плазмидные векторы экспрессируют si-РНК в виде молекул- предшественников. Предшественники содержат дцРНК размером 19-29 пар
нуклеотидов, комплементарные последовательности мРНК-мишени, и шпильку, состоящую из 6-9 нуклеотидов, которая удаляется белком Dicer с образованием молекулы si-РНК. Плазмидные векторы, экспрессирующие такие малые РНК, успешно применены для подавления экспрессии специфических генов. Эффективными системами доставки si-РНК являются вирусные векторы на основе аденовирусов и ретровирусов, которые обеспечивают стабильную и продолжительную экспрессию малых РНК. Для доставки si-РНК в клетки используют также наночастицы. Они характеризуются высокой специфичностью к определенным молекулам РНК и к определенным клеткам, тем самым, исключая связывание с нецелевыми клетками. Разработан метод доставки наночастиц, содержащих специфические последовательности si-РНК, в клетки больных меланомой. Анализ показал, что наночастицы, нагруженные si-РНК, успешно ингибировали экспрессию ключевого опухолевого гена RRM2, контролирующего деление раковых клеток.
К генной терапии также относят генно-инженерные разработки, когда клетки модифицируют, чтобы усилить иммунный ответ организма на нежелательные явления, вызванные инфекцией или возникновением опухолей. Модификация осуществляется введением новой генетической информации в клетки, против которых хотят увеличить иммунный ответ, либо в клетки иммунной системы, с помощью которых хотят усилить этот эффект. В разработке "противоопухолевые вакцины", способные усилить иммунную реакцию организма и представляющие собой опухолевые клетки с дополнительными генами поверхностных антигенов, которые экспонируясь на поверхности опухолевой клетки, усилят ее идентификацию и вызовут иммунный ответ. Также разрабатываются модификации клеток иммунной системы, направленные на уничтожение опасных клеток.
Итак, в настоящее время более 4000 заболеваний человека классифицируют как генетические. Лишь небольшая часть из них картирована. Рецессивные генетические болезни, такие как муковисцидоз и недостаточность аденозиндезаминазы, проявляются, если повреждены оба аллеля гена. В
доминантных аутосомных болезнях, например, болезнь Хантингтона, эффект больного гена проявляется, даже если другой аллель здоров. Наконец, заболевания, сцепленные с Х-хромосомой, проявляются только у мужчин. Генная терапия может применяться для монофакторных и полифакторных заболеваний. Большинство болезней современного общества, такие как рак, атеросклероз, нейропсихиатрические болезни имеют существенный генетический компонент и могут рассматриваться, как объекты классической генной терапии. Но в этих случаях необходимо выяснять механизмы межгенных взаимодействий, включая механизмы экспрессии генов, что непросто.
В целом, к 2012 г. около 400 проектов по генной терапии находятся на различных стадиях клинических испытаний: более 200 из них проходит первую стадию (оценка токсичности), 133 - вторую (испытание на небольшой группе тяжелобольных пациентов) и только 3 проекта (два по лечению рака мозга и один по гемофилии) - на заключительной третьей стадии (масштабные клинические испытания). Пока генная терапия применяется в основном в онкологии (более 60% проектов). Примерно по 15% приходится на генную терапию инфекционных (СПИД, гепатит В, туберкулез) и моногенных заболеваний (муковисцидоз, семейная гиперхолестеринемия, мукополисахаридозы, гемофилия А и др.).
Итоги двадцатилетней практики показали, что генная терапия пока далека от широкого практического использования. Основные успехи достигнуты на моделях. Но человек это не просто большая мышь [Crystal ea 1995]. Накапливается факты, свидетельствующие о негативном опыте. У пациента с муковисцидозом, которому аденовирусный вектор с кДНК вводили в легкие, возник воспалительный процесс, хотя у мышей не наблюдалось токсичности при 1000 кратно больших дозах. Главной проблемой при лечении опухолей является преодоление барьеров для проникновения терапевтического агента в опухоль с минимальной токсичностью для здоровых клеток. Модели дают очень обещающие результаты, которые не подтверждаются на людях, поскольку их физиология и биохимия сильно различны. 17 сентября 2000 г. в Университете
Пенсильвании умер 17 летний юноша, которого пытались вылечить путем генной терапии от наследственного заболевания печени. Он умер вследствие гиперреакции имунной системы на ввод в печень генно-инженерного аденовируса. Этот факт стал тревожным сигналом для многих медицинских центров, начинающих генную терапию, т.к. в 30% случаях для доставки генов используются аденовирусные вектора. Оказалось, что еще до смерти юноши от инъекций аденовирусов умирали обезьяны и у добровольцев по аналогичному лечению, получавших более низкие дозы вируса, наблюдалась сильная интоксикация печени. Этот случай заставил пересмотреть все подходы с вирусной доставкой трансгена в организм больного и привел к приостановке применения методов генной терапии. Кроме того, не все из вводимых генов достигают цели, и не все, попавшие в поврежденную клетку, эффективно экспрессируются. Подтверждается проблема использования вируса в качестве переносчика гена. Организм встречает вирус как «чужака», и у некоторых пациентов из-за этого наблюдается тяжелая иммунная реакция.
В целом, генная терапия является принципиально новым перспективным направлением в медицине. За короткое время существования новая дисциплина прошла огромный путь от экспериментальной разработки до практического применения, накоплен огромный объем информации, вложены колоссальные денежные средства. Хотя практические наработки и успехи генной терапии пока скромны, есть основания полагать, что в будущем стремительное развитие протеомных, геномных и информационных технологий помогут достичь серьезных успехов в лечении многих заболеваний человека и приведут к широкому применению этих методов в клинической практике.
В заключении о проблеме клонирования человека, она сложна, многокомпонентна и требует широкой обсуждения во всех слоях общества. Методология клонирования человека пока несовершенна, но это дело времени. В результате генно-инженерными методами будет клонирована биологическая копия индивидуума, клонировать личность человека невозможно. Поэтому нужны строгие законодательные и этико-правовые критерии для проведения
такой процедуры. В связи с чем, эксперименты по клонированию человека и генная инженерия зародышевой линии запрещены во всех европейских государствах и в большинстве высокоразвитых стран.
Основная литература
1. Ленглер Й., Древс Г., Шлегель Г. Современная микробиология. Прокариоты. (В двух томах) // М.: Мир, 2009. -653 с.(1 том), 493 с.(2 том)
2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия // Новосибирск: Сибирское университетское издание, 2004. - 496 с.
3. Жимулев И.А. Общая и молекулярная генетика // Новосибирск: Сибирское университетское издание, 2004. - 480 с.
4. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Том 1 и 2 // М.: Мир, 1998. - 766с.
5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение // М.: Мир, 2002. - 590 с.
6. Brown E. Genomics, 2-th ed. - New York: W.H.Freeman & Co. - 2002. - https://www.ncbi.nih.gov/book/genomic
7. Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaria P., Baltimor D., Darnell D. Molecular Cell Biology. Eds- 4-th ed. // New York: W.H. Freeman & Co. - 2000. - https://www.ncbi.nih.gov/book/Molecular Cell Biology/Recombinant DNA and Genomics
8. Eds. Griffits A.J.F., Gelbart W.M., Miller J.H., Lewontin R.C. Modern Genetic Analysis // New York: W.H. Freeman & Co. - 1999. - https://www.ncbi.nih.gov/book/Modern Genetic Analysis/Recombinant DNA technology
9. Albe, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. Molecular Biology of the Cell // New York: 2002 - https://www.ncbi.nih.gov/book/Molecular Biology of the Cell/Basic Genetic Mechanisms
10. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. – 1997. Feb 27;385(6619):810-3.
11. Crystal R.G. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success // Science.
– 1995. Oct 20;270(5235):404-10. Review. PMID: 7569994 [PubMed - indexed for MEDLINE]