Получение генетически модифицированных животных, трансгенных животных, в которых экспрессируются чужеродные гены, направлено на получение новых генетических линий, которые сохраняют исходные полезные признаки и приобретают новые. Эксперименты по получению трансгенных животных направлены на включение в хромосомы животных как отдельных функциональных генов так и целых генных кластеров. Животное, чей генотип изменяется путем введения чужеродной ДНК, называют трансгенным, вводимая ДНК – трансгеном, а процесс – трансгенной технологией или трансгенозом.
Начало эпохи клонирования уходит в 40-е годы прошлого столетия, когда российский эмбриолог Георгий Викторович Лопашов впервые в мировой практике разработал метод трансплантации ядер в яйцеклетку лягушки. В 1948 году он отправил статью по результатам экспериментов в российский «Журнал общей биологии». Статья не вышла в связи с постановлением государственных органов (от 1948 г.) о запрете науки генетики в России. Позже в 50-е годы аналогичные эксперименты опубликовали американские эмбриологи Бриггс и Кинг и научный приоритет достался им. В дальнейшем Дж. Гердон из Великобритании добился того, что яйцеклетки лягушек с чужеродным ядром соматической клетки развивались и давали потомство. В 1982 г. на обложку журнала “Nature” поместили фотографию двух десятинедельных мышей, из которых одна была больше другой в два раза (фотография из статьи в этом же номере журнала). Большая из 2-х мышей была трансгенной мышью, в эмбрион которой введен чужеродный ген - ген гормона роста крысы. После публикации этой статьи начались многочисленные эксперименты по созданию трансгенных животных.
Сегодня трансгенная биотехнология животных – это быстро развивающееся направление генной инженерии, методология которой разрабатывалась на лабораторных мышах. С начала 80-х в различные линии мышей были введены самые разные гены с целью исследования фундаментальных биологических процессов и многих заболеваний. Введение чужеродной ДНК в организм животного можно осуществить разными методами: с помощью ретровирусных векторов, микроинъекцией ДНК, с помощью стволовых клеток, переносом ядра и с помощью искусственных хромосом.
Использование ретровирусных векторов. Для получения линии трансгенных мышей эмбрион на стадии 8 клеток инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. «Суррогатные матери», которым имплантируют эмбрион, производят трансгенное потомство. Для идентификации трансгена трансгенных мышат скрещивают для получения особей, гомозиготных по трансгену, и анализируют с помощью ДНК- гибридизации клетки из кусочков кончиков хвостов. При использовании этого метода размер вставки ограничен 8000п.н. Кроме того, ретровирусные вектора способны реплицироваться в организме трансгенного животного, что нарушает допустимые критерии для применения трансгенных животных в практических целях.
Поэтому используют технику микроинъекций ДНК. Метод включает выделение из самок-доноров яйцеклеток после их спаривания с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в оплодотворенные яйцеклетки, которые имплантируют в суррогатную мать для получения трансгенного потомства. Эффективность трангеноза после микроинъекций низкая: после трансфекции трансгенной конструкции в оплодотворенные яйцеклетки, успешной имплантации и появления потомства трансгенные особи составляют менее 5%. Выход значительно ниже для коров, свиней и овец.
Использование э мбриональных с тволовых клеток (ES-клетки). Они способны пролиферировать в культуре, сохраняя способность к
дифференцировке в любые типы клеток, включая клетки зародышевой линии при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называют полипотентными, их легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения этого свойства. ES-Клетки в культуре трансфецируют вектором с чужеродной ДНК. Конструкция кроме чужеродного гена содержит селективный маркер, например, ген устойчивости к неомицину. Тогда при культивировании рекомбинантных клеток на среде с неомицином немодифицированные клетки погибают. Модифицированные ES-клетки вводят в реципиентную бластоцисту, которую имплантируют в суррогатную мать. Анализируют трансгенных животных, некоторые из которых содержат трансген. Таких животных отбирают для скрещивания и получения линии трансгенных мышей. Самый простой способ идентификации ES-клеток, несущих трансген в нужном специфическом сайте сайте, основан на использовании ПЦР. При тестировании трансфецированных клеток один из ПЦР-праймеров (Р1) комплементарен участку клонированной последовательности, а второй (Р2) – участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. Тогда при встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовываться не будет, а при сайт-специфическом встраивании амплифицируется ДНК известного размера. Так можно идентифицировать ES-клетки, содержащие трансген в нужном сайте, и путем пересева получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой. Такие клеточные линии можно использовать для трансгеноза. Впервые стволовые клетки обнаружены у мышей и технология трансгеноза разработана для них. Впоследствии ES-клетки обнаружены у других млекопитающих, такие клеточные линии получены для золотистого хомячка (1988), овцы (1990), обезьяны (1995), свиньи (1999) и даже человека (1994). Технология ES-клеток открыла новые возможности для создания трансгенных животных с дополнительными введенными генами либо выключенными генами.
Выключение гена называют генным нокаутом. Чтобы ген не экспрессировался нарушают его рамку считывания путем встраивания в кодирующую область чужеродной последовательности (обычно селективного маркерного гена). Для этого создают векторную молекулу, содержащую последовательности, гомологичные фрагментам нарушаемого гена-мишени, и ген устойчивости к неомицину. После введения вектора в клетки в результате гомологичной рекомбинации сдвигается рамка считывания гена-мишени и соответствующий ему белок не синтезируется. Экспрессия вставки обеспечивает устойчивость трансгенных клеток к неомицину и облегчает их селекцию на этапах генно-инженерных процедур. В настоящее время для избирательного подавления генной активности используют методологию РНК- интерференции. РНК-интерференция – это посттранскрипционное подавление экспрессии генов с помощью гомологичных им по нуклеотидной последовательности двухцепочечных РНК (дцРНК). При введении в клетки искусственно синтезированных дцРНК наблюдается избирательное и эффективное подавление экспрессии гомологичных ей генов. Поэтому синтезируют дцРНК, гомологичную гену-мишени, который необходимо выключить, и вводят ее в клетки. Подавляется экспрессия только гена-мишени. Задача направленного отключения генов состоит в выяснении влияния продуктов этих генов на протекающие физиологические процессы и развитие организма в целом. Такие трансгенные животные могут служить для моделирования болезней человека на молекулярно-генетическом уровне. Например, на мышах с «нокаутированным» геном родопсина, что ведет к инактивации палочек сетчатки, можно изучать процесс дегенерации сетчатки, а также эффект лекарственных средств, оказывающих терапевтическое действие и замедляющих либо останавливающих патологию. Создано более 250 линий мышей с нокаутированными генами для изучения различных заболеваний человека.
Клонирование переносом ядра. Метод заключается в переносе ядра тестируемой клетки в безъядерную яйцеклетку с последующим отбором
потомства. Историческим примером является клонирование овечки Долли [Wilmut et al., 1997]. Для этого первоначально микропипеткой удаляли ядро яйцеклетки. Клетки эпителия молочной железы культивировали и синхронизировали, добивались, чтобы клетки переходили в стадию покоя – G0. Затем осуществляли слияние соматических клеток и безъядерных яйцеклеток, восстановленные яйцеклетки выращивали в культуре. На следующем этапе проводили имплантацию яйцеклеток в суррогатную мать, где развивался эмбрион. В эксперименте, описанном Вильмутом, проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе G0, в результате из 29 образовавшихся эмбрионов только один дал жизнеспособный плод [Wilmut et al., 1997].
Результативность клонирования животных в ранних экспериментах на шпорцевой лягушке была также низкой. В 1976 г. Дж. Гердон и Р. Ласки публикуют работу, в которой описывают опыты с ядрами, выделенными из клеток почек, кожи и легкого уже взрослых шпорцевых лягушек. Исследователи выращивают эти клетки вне организма, а затем вводят их ядра в безъядерные икринки. До 25% таких икринок начинает делиться, но процесс развития пролонгируется. Исследователи выделяют ядра из полученных эмбрионов и снова помещают их в безъядерные икринки. В результате серии подобных пересадок рождаются несколько головастиков. Хотя эти эксперименты привели к получению клонов амфибий, появляющиеся на свет головастики не доживали до стадии взрослых лягушек. Но млекопитающие значительно сложнее лягушки по устройству и степени дифференцированности тканей и выход клонов у них гораздо меньше.
После появления овечки Долли успешное клонирование проведено для мышей (1998), коров (1998), овец (1999), свиней (2000). К настоящему времени накоплено достаточно опыта для анализа этих экспериментов. Результаты клонирования свидетельствуют о массовой гибели эмбрионов в перинатальный период и трагических дефектах в неонатальный период. Перинатальную смертность связывают с нарушениями в регуляции экспрессии генов, и прежде
всего, с нарушением эпигенетической регуляции экспрессии. Именно с нарушениями в экспрессии генов у клонов ассоциируется и неонатальная смертность. Получить генетически идентичную копию организма в настоящее время, по-видимому, невозможно. Клонированные мыши отличаются друг от друга по некодирующей микросателлитной ДНК, которая играет важную роль в регуляции экспрессии. Кроме того для клонирования часто используются соматические клетки. У некоторых организмов в соматических клетках в ходе развития делетированы фрагменты ДНК (дрозофила). В соматических клетках теломерные последовательности хромосом укорочены по сравнению с теломерами клеток зародышевой линии. Также в матке разных приемных матерей будут различаться условия для развития клонированных эмбрионов, а при развитии зародыша даже совсем незначительные колебания среды могут привести к эпигенетическим нарушениям в регуляции генов. И чем организм более специализирован и выше его положение на эволюционной лестнице, тем эти изменения глубже и менее обратимы. Анализ опыта клонирования различных животных привел к публичному выступлению создателя овечки Долли в 2001 г.: в его соавторстве была опубликована статья в журнале
«Science». Статья называлась «Не клонируйте людей!», в которой авторы призывают все попытки клонирования человека признать преждевременными, опасными и безответственными до выяснения всех рисков, связанных с фундаментальными научными вопросами ядерного клонирования. Авторы подчеркивают, что эта позиция относится к экспрессии целых геномов и не распространяется на развитие технологии ES-клеток и генной терапии человека, поскольку в этом случае трансгены экспрессируются в клетках конкретного типа ткани.
Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом. Большинство клонированных эукариотических генов представляют собой кДНК, т.е. небольшие гены размером до 20 кб или фрагменты генов. кДНК плохо экспрессируется в клетках млекопитающих, а полноразмерные эукариотические гены слишком велики для встраивания в обычные векторные
молекулы. Поэтому для получения трансгенных животных можно использовать искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), вмещающие фрагменты геномной ДНК длиной до 1 Мб.
Трансгенных мышей получали микроинъекцией YAC в ядро оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ES-клеток с помощью YAC, несущих либо несколько генов, либо один большой ген. Трансгенные мыши, содержащие на YAC-хромосоме кластер из пяти функциональных генов b- глобина человека длиной около 250 кб, экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время – также как это происходит у человека. Это определялось наличием во фланкирующих генах последовательностей промоторов и всех необходимых регуляторных элементов. Разрабатывается технология для синтеза человеческих моноклональных антител линиями трансгенных мышей для использования их в медицине.
Для чего используются трансгенные животные? Прежде всего, трансгенные животные рассматриваются как перспективные продуценты лекарственных белков на основе генов человека. В отличие от бактерий в организме животных человеческие белки претерпевают правильные модификации на посттрансляционном уровне – гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, карбоксилирование и др. преобразования. Биохимические механизмы, обеспечивающие эти реакции, отсутствуют у прокариот, и белки, синтезируемые ими с генов человека, не полностью идентичны белкам человеческого организма. Трансгенные дрожжи не имеют эти недостатки, но их продуктивность ниже, чем у трансгенных животных.
Технология построена на получении трансгенных животных, в специализированных клетках которых, и, в частности, в клетках молочной железы, экспрессируются человеческие целевые белки. В этом случае получение лекарственных белков производят путем доения животных, а их последующая очистка проходит из животного молока, и если в препаратах остаются примеси, то это будут контаминирующие молочные белки, нетоксичные для человека. Техника отработана на мышах, получены
трансгенные мыши, способные синтезировать в молоке человеческие интерферон, сывороточный альбумин, урокиназу, интерлейкин-2, супероксиддисмутазу и др. Получены также трансгенные кролики, овцы и козы, активно ведутся работы по получению трансгенных коров.
Другое направление использования трансгенных животных – это моделирование генетических заболеваний. Немногие заболевания имеют моногенную природу, чаще причиной является комплекс нарушений генома, включая механизмы взаимодействия между генетическими и окружающими факторами. Исследования направлены на выяснение генетических основ таких заболеваний. К этой группе относят заболевания мозга и нервной системы, многие эндокринные заболевания. Идентифицированные гены нейродегеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и хорея Гентингтона, уже используются в моделировании на трансгенных животных. Для многих заболеваний трудно установить причину, поэтому привлекаются трансгенные модели. Идентифицированы гены, продукты которых участвуют в развитии эпилепсии. Некоторые воспалительные и иммунологические заболевания имитируют с помощью одноступенчатого трансгенеза, например, ревматоидный артрит. Получены мыши, содержащие гены ВИЧ-1 для выяснения путей развития этого заболевания и борьбы с ним. Моделируются болезни, связанные с липидным обменом, с развитием сердечно-сосудистых заболевыаний и гипертонии. Понимание молекулярно-генетических механизмов формирования заболеваний с помощью трансгенных животных важно для развития профилактики и диагностики. Среди млекопитающих наиболее развита техника моделирования на мышах. Создают два типа моделей: мыши с функционирующим трансгеном и мыши с утратой функции данного гена. На первой модели исследуют взаимосвязь экспрессии гена и степенью заболевания, на второй модели – конкретную функцию гена, его роль в заболевании, что особенно важно при анализе причин мультигенных болезней. Разработка методов генной терапии – наиболее актуальное направление в применении трансгенных животных. Эти исследования
актуальны в борьбе с онкозаболеваниями и спидом, а также другими соматическими болезнями. Используется соматическая трансфекция, когда генетические конструкции вводятся в определенные клетки пациента.
Перспективу в развитии новых трансгенных технологий связывают с созданием трансгенных животных – источников органов для пересадки человеку. Например, органы свиньи подходят человеку по строению, размеру и биохимическим показателям. Их прямая пересадка невозможна, они будут отторгнуты иммунной системой пациентов. Проблема может быть решена путем создания трансгенного животного с человеческими генами гистосовместимости.
Технологией трансгеноза получены трансгенные коровы, овцы, свиньи, птицы и рыбы. Возможно, развитие этой техники позволит получать улучшенные породы домашних животных с новыми свойствами. Кроме того, трансгенных коров, овец и коз будут использовать для получения полезных для человека продуктов, которые секретируются в молоко. Особые надежды связывают с моделированием генных болезней человека и разработкой методов их преодоления. Клонирование животных для использования их как фабрик гормонов для людей уже развивается усиленными темпами. Возможно будут и другие области применения трансгенных животных, но очевидно одно, что развитие и прогресс этой технологии, также как и микробной биотехнологии, неразрывно связан с будущим человечества.