Генетическая инженерия растений

Генетическая инженерия растений заключается в переносе в растительные организмы чужеродных генов, которые обуславливают новые полезные свойства рекомбинантных растений. Получение трансгенных растений важно по следующим причинам: во-первых, введение гетерологичных генов часто приводит к повышению сельскохозяйственной ценности и декоративных качеств растений, что обеспечивает их высокую конкурентоспособность; во- вторых, доступность трансгенных растений, которые могут продуцировать полезные для человека продукты при минимальных экономических затратах; в

третьих, растения являются удобными моделями для изучения действия новых

генов в ходе полного цикла биологического развития организма. Методология генетической инженерии растений направлена на изменение методов традиционной селекции, чтобы желаемые признаки растений можно было получать путем введения в хромосомную ДНК соответствующих генов вместо длительной и трудоемкой селекции. В целом, стратегия получения трансгенных растений аналогична для микроорганизмов и животных: необходимо сконструировать гетерологичную ДНК, несущую целевые гены, найти оптимальный способ ее введения в клетки растения и получить стабильную экспрессию продукта. Тем не менее, в отличие от микроорганизмов, растительные геномы на порядки больше по объему, имеют гораздо более сложное строение (высокая плоидность, превалирующее количество некодирующей ДНК, включающую сателлитную и мобильную ДНК), не содержат плазмид, а главное, число секвенированных геномов в мировых базах данных, гораздо меньше, чем других организмов в силу трудоемкости ее секвенирования. Чужеродная ДНК встраивается в хромосомную ДНК растений, поэтому необходимо контролировать, в какой именно ткани растений ожидается экспрессия целевых генов (путем подбора специфических промоторов). Дополнительной сложностью является то, что в геноме растений и других эукариот не все участки транскрибируются, что означает, что экспрессия чужеродного гена будет зависеть от вида ткани. Также растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением способных завязывать жизнеспособные семена, что обеспечивает передачу желаемого признака последующим поколениям растений. Таким образом, тотипотентность открывает для генных инженеров перспективу в направленной селекции растений, а также в изучении функционирования новых генов. Для такого конструирования необходимо выделить конкретный ген, разработать методы его включения в наследственный аппарат растительной клетки и далее регенерировать из единичных клеток нормальное жизнеспособное растение с измененным генотипом. В отличие от животных

растительные клетки имеют клеточную оболочку, которая затрудняет доставку в них ДНК. Поэтому технология получения трансгенных растений из единичных клеток расширяет возможности генно-инженерной методологии.

Для создания трансгенных растений используют два пути: первый – это векторный перенос чужеродной ДНК путем трансформации его агробактериями, а второй - методы прямого переноса генов в клетки растений.

Генетическая трансформация растений основана на природном процессе. В основе – инфекционный процесс, а именно, заражение растений почвенными бактериями рода Agrobacterium. Несколько видов этих бактерий могут заражать растения и вызывать образование опухолей (корончатые галлы), растущие в месте заражения. Клетки корончатых галлов способны к нерегулируемому росту и сохраняют эти свойства, даже если убить бактерии антибиотиками. Изучение индуктора опухолей Agrobacterium tumefaciens показало, что этому способствуют плазмиды, которые частично интегрируется в хромосомы растений. Таким образом, у фитопатогенных агробактерий реализуется редкая форма паразитизма, связанная с внедрением в геном растений части собственной бактериальной ДНК. Таким образом, эти микроорганизмы от природы способны осуществлять задачи генной инженерии.

Суть инфекционного процесса в следующем (Рис. 22). Заболевание определяется экспрессией в растительном геноме специфического сегмента бактериальной плазмиды, он называется Т-ДНК, размером до 24 кб. Т-ДНК входит в состав бактериальной Ti-плазмиды (t umor i nducing – индуцирующая опухоль) размером до 200 кб. Кроме Т-сегмента в плазмиде есть еще два принципиально важных участка: vir-участок – гены вирулентности, которые обеспечивают перенос Т-ДНК и con-участок, который обеспечивает процесс коньюгации плазмиды. В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов. Во-первых, Т- ДНК содержит гены ферментов, необходимых для синтеза регуляторов роста растений (ауксин и цитокинин).

Рис. 22. Схема природной трансформации растений агробактериями. а) Растущее растение, ризосфера которого инокулирована агробактериями; б) Agrobacterium tumefaciens, несущие Ti-плазмиду с локализованной в ней Т-ДНК; с) перенос Т-ДНК из плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки; д) образование корончатых галлов растений следствии экспрессии бактериальной Т-ДНК. [Modern Genetic Analysis. Griffiths AJF, Gelbart WM, Miller JH, et al. New York: W. H. Freeman; www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21428/]

В трансформированных клетках растений идет усиленное образование этих гормонов, что вызывает разрастание ткани. Поэтому эти бактериальные гены считают онкогенами. Бактериальная Т-ДНК также содержит гены опинсинтаз для синтеза необычных аминокислот, называемых опины. В зависимости от типа Ti-плазмиды, опухолевые клетки образуют опины различных типов, из них наиболее известны нопалин и октопин – производные аргинина. Эти модифицированные аминокислотыне образуются в растительных клетках, но не используются растениями, а необходимы для паразитирующих бактерий, и используются ими как источники углерода и азота. Бактериальные гены, необходимые для поглощения и катаболизма опинов, локализованы в Ti- плазмидах и поэтому опины используются только штаммами агробактерий, а не другими почвенными бактериями. Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируют в зараженном растении ни образования корончатых галлов, ни

синтеза опинов. Таким образом, растительные клетки, которые экспрессируют эти гены, становятся источником питания для бактерий.

В переносе Т-ДНК участвуют продукты кластера vir-генов Ti-плазмиды (рис. 23). В результате такого переноса Т-ДНК встраивается в геном растительной клетки.

Рис. 23. Схема строения Ti-плазмиды: Т-ДНК содержит гены регуляторов роста растений, ответственных за онкотрансформацию растительных клеток и синтез нопалинов, модифицированных аминокислот, служащих источником питания для агробактерий. vir - Гены кодируют белки, обеспечивающие перенос Т-ДНК в растительную клетку. [Modern Genetic Analysis. Griffiths AJF, Gelbart WM, Miller JH, et al. New York: W. H. Freeman; www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21428/]

Агробактерии самостоятельно не способны разрушать растительную клеточную стенку. Трансформация растений происходит в местах повреждения клеточной стенки растений. Индукция переноса бактериальной ДНК происходит под действием фенольных соединений, освобождающихся в участках повреждения растительной ткани. Индукцию vir -генов стимулирует также присутствие ряда сахаров, например, арабиноза или галактоза. Оптимальные условия индукции обусловлены штаммом агробактерий и типом растения-хозяина. Индукцию vir -генов индукторами растительного происхождения опосредует двухкомпонентная регуляторная система сигнальной трансдукции, включающая гистидиновую протеинкиназу VirА в

качестве сенсорного компонента и фактор транскрипции VirG в качестве ответного регулятора. Белок VirA дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной клетки и выступает в качестве донора фосфата для белка VirG, который в фосфорилированной форме активирует транскрипцию vir -генов, связываясь с последовательностью ДНК длиной 12 п.н. (vir -боксы). Активация vir -генов под контролем этой сигнальной системы обеспечивает вырезание Т- ДНК, ее перенос в клетки растений и интеграцию в геном растений. Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин нежизнеспособный, перенос Т-ДНК не осуществляется. В сайт-специфичном вырезании Т-ДНК участвуют продукты генов оперона virD, один из них является эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами, которые являются сайтами узнавания для VirD-эндонуклеазы. После удаления концевых повторов высвобождается линейная одноцепочечная Т-ДНК. С ней связывается белок VirЕ, способный защищать Т-ДНК от действия расщепляющих ферментов. Т-ДНК покрывается примерно 200 молекулами этого белка для сохранения и переносится через специфические каналы, образованные VirВ-белком в растительную клетку. VirВ – это мембранный или периплазматический белок, образующий пору, через которую выходит Т-ДНК. Перенос основан на белок-белковом взаимодействии, Т-ДНК полностью замаскирована белками и ее нуклеотидный состав не нарушается и не влияет на процесс переноса. Т-ДНК должна проникнуть в ядро. Перенос через ядерную мембрану происходит через поры и опосредуется участками узнавания к VirE белку. В отличие от мобильных элементов, Т-ДНК не несет гены специальных ферментов для встраивания в геном растительной клетки (Рис. 24).

Нопалиновый участок Т-ДНК Гены регуляторов роста растений

Рис. 24. Схема Т-ДНК в Ti-плазмидном векторе агробактерий: нопалиновый участок содержит гены для синтеза необычных аминокислот, активация генов регуляторов роста растений в растительных клетках приводит к развитию корончатых галлов.

Интеграция Т-ДНК происходит случайным образом, не обнаруживая избирательности в отношении геномных локусов, но, по-видимому, предпочтительно в областях активной транскрипции.

Конструирование генетических векторов на основе Ti-плазмиды. Конструирование осуществляют путем замены Т-ДНК в Ti-плазмидном векторе агробактерий на чужеродные гены. А именно, Т-ДНК может быть вырезана и заменена нуклеотидную последовательность, которую хотят ввести в растение. Удаление нативной Т-ДНК из плазмиды приводит к тому, что болезнь не развивается. Вырезание/встраивание осуществляют рестриктазами и лигазами. К чужеродным генам подстыковывают растительный промотор или промоторы фитовирусов. Иногда подстыковывают промоторы, обеспечивающие тканеспецифичную экспрессию чужеродного гена. Широко используются промоторы, под контролем которых гены экспрессируются конститутивно. Природная Ti-плазмида содержит участки, которые не требуются для искусственной трансформации, поэтому их делетируют, а из природных плазмид конструируют более мелкие векторы, с которыми удобнее работать. Обязательным условием является сохранение в плазмиде пограничных последовательностей Т-ДНК и присутствие в составе вектора vir -генов. Отбор трансформантов осуществляют на селективных средах, для этого в векторную конструкцию вводят селективный маркерный ген, обычно ген устойчивости к антибиотику или репортерный ген. Достоинством векторного переноса является возможность манипулировать с генами, недостатком – встраивание гетерологичной ДНК в случайные локусы растительной ДНК, что преодолевают путем использования специфичных промоторов. Кроме того, векторный перенос лимитирован применением ограниченного числа видов растений, на которых паразитируют агробактерии. Более того, на практике получают более сложные конструкции, предназначенные для переноса в растения, которые по размеру не вмещаются в бактериальную плазмиду. Поэтому разработаны и другие способы генетической трансформации растерий.

Наряду с векторным переносом осуществляют прямой перенос ДНК без участия микроорганизмов. К таким методам относится метод соматической гибридизации. Он заключается в слиянии протопластов растительных клеток. Таким образом, в клетку можно ввести большой объем ДНК, а чем больше ДНК, тем выше вероятность встраивания гетерологичной ДНК. Недостатком этого метода является отсутствие прогнозирования результата. Другой подход заключается в том, что клеточную стенку растений удаляют ферментами и в протопласты вводят чужеродную путем микроинъекций микрошприцом под контролем микроскопа, электропорацией или слиянием с липосомами, содержащими ДНК. Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.

Один из самых эффективных методов трансформации растений, особенно однодольных - это метод генной пушки. Для этого векторная ДНК напыляется на мельчайшие частички металла (размером до 1 мкм). Частички с ДНК наносят на подложку и помещают внутрь пушки. Растительные клетки наносят на агаризированную среду в чашку Петри и она помещается под пушку на расстоянии около 10 см. Давление в пушке уменьшают до 0.1 атм, в момент сброса давления частицы с огромной скоростью выбрасываются из пушки, стремительно проходят через клеточные стенки растений и проникают в цитоплазму и ядро клеток. Среди множества клеток, подвергнутых бомбардировке, имеются клетки, в которых трансформация прошла успешно. Клетки осторожно переносят на среду для отбора, культивирования и регенерации. Присутствие чужеродных генов устанавливают с помощью метода ПЦР или постановки активности. С помощью генной пушки получены

трансгенные кукуруза, рис, пшеница, ячмень, растения-трансформанты отличались стабильностью. Кроме успехов в получении трансгенных однодольных, трансформация генной пушкой применяется для прямого переноса ДНК в пыльцу. Этим методом проведена трансформация растений табака и получены стабильные трансформанты.

Трансформация хлоропластов. Высокий уровень экспрессии в трансгенных растениях достигается при трансформации хлоропластов. Каждая клетка содержит до 100 хлоропластов, в каждом из которых содержится от 50 до 100 копий дуплексной кольцевой молекулы ДНК. Таким образом, в отличие от ядерной трансформации трансформация в хлоропласты сопровождается увеличением копийности чужеродного гена. Экспрессия в ядерных трансформантах в значительной степени зависит от места встраивания. Сайт- специфическая интеграция целевых генов в ДНК хлоропластов обеспечивает отсутствие инсерционного мутагенеза. Хлоропласты имеют собственные системы трансляции и транскрипции, близкие прокариотическим, что облегчает использование при трансформации бактериальных генов. Протопласты наследуются как цитоплазматические элементы, что обеспечивает их наследование по материнской линии. В результате чужеродные гены остаются только в культуре, которая была генетически модифицирована. Важно, что в настоящее время секвенирована ДНК хлоропластов более двух десятков важнейших культурных растений, что обеспечивает развитие этой технологии.

Практическая значимость трансгенных растений для нужд сельского хозяйства. Острая проблема в сельском хозяйстве – это получение растений, устойчивых к вирусам. Одна из методологий получения безвирусных растений

– это иммунизация вирусными генами. Для этого отдельные вирусные гены, например, ген капсидного белка вируса вводят в геном растения. В этих условиях инфицирующая способность вируса резко снижается. Ингибирование вирусной инфекции происходит за счет механизма РНК-интерференции, в результате происходит высокоизбирательное расщепление вирусной мРНК в присутствии комплементарной ей молекулы дцРНК. Противовирусное действие

проявляется на уровне трансляции и препятствует образованию зрелых вирусных частиц. Этим способом получены уже различные трансгенные растения, устойчивые к фитовирусам.

Другой метод получения безвирусных растений – введение в растительную клетку антисмысловой РНК (асРНК). асРНК образует дуплекс с мРНК и блокирует трансляцию. В in vitro экспериментах синтез белкового продукта в присутствии асРНК существенно снижается, что легло в основу метода получения безвирусных растений. Для этого в растительные клетки вводят ген, кодирующий асРНК, комплементарную мРНК вирусного белка оболочки. Введение такого гена позволяет контролировать экспрессию интересуемого гена. Показано, что экспрессия такого гена снижала, но не блокировала развитие инфекции.

Защита растений от вирусов также обеспечивается также с применением противовирусных белков. Такие белки синтезируются самими растениями, а также бактериями, это рибонуклеазы и нуклеазы, обе расщепляют вирусную нуклеиновую кислоту. Гены этих белков клонируют и используют для получения трансгенных растений., устойчивых к широкому спектру вирусов.

Растения, устойчивые к насекомым. Для создания устойчивых к насекомым растений в растительный геном встраивают ген бактериального токсина, выделенный из B acillus t huringiensis (эти почвенные бактерии вызывают болезни насекомых, выделяя Вt-токсин). Трансгенные растения, способные к синтезу Вt-токсина, проявляют устойчивость к некоторым из вредителей. Это позволяет снизить применение пестицидов на полях, что уменьшает загрязнение окружающей среды. Наиболее безопасные проекты связаны с трансгенным хлопчатником, синтезирующим бактериальный Вt- токсин. Другая сельскохозяйственная масленичная культура – это устойчивый к насекомым трансгенный рапс, такие растения позволили получить техническое растительное масло с меньшими затратами. Основным преимуществом в использовании Вt-растений является увеличение урожайности и уменьшение использования гербицидов и инсектицидов.

Улучшение качества пищевых сельскохозяйственных продуктов. Многие растительные продукты содержат недостаточные количества незаменимых аминокислот и витаминов. Этот недостаток преодолевают, внедряя в растительный геном гены, ответственные за биосинтез запасных белков, в которых чаще считываются кодоны незаменимых для человека аминокислот, прежде всего - лизина. Созданы сорта масленичных культур с измененным составом жирных кислот в плодах (соя, рапс, подсолнечник). Улучшается вкус фруктов путем введения гена белка, имеющего сладкий вкус. В настоящее время получены трансгенный рис с повышенным содержанием каротиноидов, трансгенная соя с улучшенным белковым составом.

Улучшение товарных качеств растений. Изменение вкуса, внешнего вида и сохранности плодов важно для реализации сельскохозяйственной продукции. При созревании плодов растений активируются различные гидролитические ферменты. Были созданы трансгенные растения, в которых синтезировались антисмысловые РНК-версии этих генов. Такой подход использован для получения трансгенных томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал кДНК гена полигалактуроназы, участвующей в расщеплении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Полигалактуроназа синтезируется в период созревания плодов томатов, увеличение ее количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Были созданы трансгенные растения, в которых синтезировались антисмысловые РНК-версии этих генов. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше хранились, но сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Таким образом, стратегия антисмысловых конструкций применима для модификации экспрессии генов и используется не только для получения растений с новыми свойствами, но также для фундаментальных исследований в генетике растений.

Изучение генетической регуляции развития цветка позволяет создавать махровые сорта разнообразных декоративных растений, которые пользуются большим спросом на рынке. Кроме того, в растения можно ввести гены, отвечающие за синтез пигментов и получить необычную окраску (например, получены трансгенные петунии с цветками желтого цвета). Интересным представляется экспрессия в трансгенных растениях белков, светящихся в темноте, или флуоресцирующих белков, что придаст растениям принципиально новые декоративные качества.

Растения, устойчивые к гербицидам. Одной из технологий, позволяющей удешевить борьбу с сорняками, является получение гербицид-устойчивых культурных растений. Для этого можно ввести в геном растений ген устойчивости к гербициду, модифицировать ген белка, чувствительного к гербициду или модифицировать гены,продукты которых контролируют поглощение гербицида растениями. Обработку полей с гербицид-устойчивыми культурами можно проводить весь сезон, что улучшает урожай и одновременно ведет к избытку этих агентов на полях, приводя к накоплению гербицидов или продуктов его деградации в сельскохозяйственных продуктах. Если для технических культур это сравнительно безопасно, то использовать в пищу трансгенные гербицид-устойчивые культурные растения может оказаться опасным. Многие гербициды признаны опасными для рыб, моллюсков и др. животных. Сток гербицидов с полей в водоемы также усилится. Таким образом, использование гербицид-устойчивых трансгенных растений должно быть оправдано не только экономическими критериями, но также обосновано экологически и социально, чтобы не нанести вред биосфере.

Повышение устойчивости растений. Неблагоприятные воздействия окружающей среды сопровождаются физиологическими стрессами. Следствием является образование свободных радикалов кислорода. Наиболее распространенным радикалом является супероксид-анион. Фермент супероксид-дисмутаза нейтрализует это соединение, превращая в перекись водорода, которая превращается в воду любой из клеточных пероксидаз:

O₂^*→H₂O₂→H₂O + O²

Работы по созданию растений, устойчивых к окислительному стрессу, предполагают перенос в растительные геномы генов, ответственных за синтез супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и др. ферментов под сильными промоторами, что повышает их устойчивость к свободнорадикальным процессам. Трансгенные растения табака, несущие ген супероксид-дисмутазы из хлоропластов, были устойчивы к засухе, яркому свету. Растения приобретали также дополнительные свойства, они становились более устойчивы к гербицидам. Супероксид-дисмутаза способствует также сохранению срезанных цветов при транспортировке, их увядание также является следствием образования свободных радикалов кислорода. Возможно, такие разработки окажутся актуальными для высокогорных областей с высокой UV-радиацией. По-видимому, эти растения окажутся менее чувствительными к радиоактивным загрязнениям.

В ответ на разные стрессовые воздействия, засоление, засуху, холод и др., в клетках растений активно синтезируется пролин. Эта аминокислота обладает уникальными свойствами - ее раствор в воде даже в высоких концентрациях не нарушает структуру белков, поэтому она может “работать” в качестве осмопротектора. Уровень пролина и повышение стрессоустойчивости растений можно изменить либо усилив его синтез, либо снизив скорость его распада. Были проведены эксперименты по получению растений табака, несущих антисмысловой участок гена пролиндегидрогеназы - фермента, разрушающего аминокислоту пролин. С использованием асРНК был снижен уровень экспрессии гена пролиндегидрогеназы, что сказалось на увеличении содержания пролина в клетках и повышении неспецифической стрессоустойчивости (к засолению, засухе, солям тяжелых металлов и др.).

Для нашей страны актуально получение морозостойких сортов растений. Основным повреждающим агентом при замерзании является кристаллический лед. Для предотвращения его образования некоторые рыбы и насекомые

выделяют особые гидрофильные белки. Гены этих белков можно перенести в растения, и их морозостойкость повысится.

Растения биореакторы – это растения, способные синтезировать коммерческие продукты: инсулин, антитела и др. белки для нужд медицины. Производство генно-инженерных белков в трансгенных клетках бактерий практикуют уже давно. Однако, возникает проблема правильной модификации таких белков в бактериальных клетках. Часто белок так и не принимает нужной конформации или слегка отличается по аминокислотному составу, что нежелательно. Растения являются эукариотическими организмами, способными синтезировать аутентичные белки, поэтому было предложено получать белки для нужд медицины из трансгенных растений. Можно создать условия для синтеза чужеродных белков в семенах, в которых их целостность не нарушится длительное время. Поскольку выращивание растений является доступной и освоенной методологией, а получаемый при этом продукт будет аутентичен человеческим белкам, можно ожидать большого экономического эффекта от внедрения этой технологии. В медицинской практике используется не вся биомасса растения, а выделенный из нее индивидуальный компонент (белок), т.е. препарат проходит предварительную очистку и должен быть безопасным для здоровья людей.

Подводя итог можно заключить, что несмотря на многочисленные запреты и дискуссии, практическое применение трансгенных растений уже началось. Оценка возможных рисков должна проводиться на основании анализа используемой технологии. Для технических и декоративных культур риск применения трансгенных растений минимален. В тех случаях, когда технология действительно экологически опасна, нужны действенные меры по контролю качества продукции и оценке отдаленных последствий ее применения.

Области применения трансгенных растений многообразны, к сожалению, в нашей стране эти технологии пока лимитированы. Если экономическая выгода от использования генетически модифицированных растений очевидна, то их безопасность вызывает опасения и дискуссии. Хотя до сих пор не получено ни

одного подтверждения вредоносных качеств трансгенных растений, преувеличение их опасности связано с недостатком знаний и информации.