Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой амплификацию или размножение специфического сегмента ДНК с помощью ДНК-полимеразы, т.е. это способ получения большого числа копий гена или специфических последовательностей ДНК in vitro. Метод разработан в 1985 г. К.Маллисом с сотрудниками. Процедура включает три этапа: денатурация, отжиг и синтез (Рис. 12). К исследуемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических праймера. Праймеры – это олигонуклеотиды длиной 20 оснований, которые комплиментарны участкам ДНК из противоположных цепей и ограничивают последовательность-мишень. Их 3’-ОН концы после отжига должны быть ориентированы навстречу друг другу. Длина ДНК- мишени, заключенная между двумя направленными навстречу друг другу праймерами, может варьировать от 100 до 30000 п.о. Препарат ДНК подвергают термической денатурации при нагревании до 95оС (1 мин). В процессе отжига (ренатурации) при понижении температуры до 55оС происходит эффективная гибридизация праймеров с комплиментарными последовательностями на разных цепях ДНК (Рис. 14). При этом отжиг происходит предпочтительно между праймерами и цепочками ДНК, чем между длинными цепочками ДНК. Поэтому в реакционной смеси должен быть избыток праймеров. Далее температуру повышают до 75оС – оптимальная температура для Tag -полимеразы. В присутствии избытка дезоксинуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимеразы начинается реакция полимеризации, инициируемая на праймерах. На этом первый цикл завершается. После остановки реакции ДНК снова денатурируют нагреванием. В процессе охлаждения праймеры вновь эффективно гибридизуются, причем не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. В первом раунде каждая из новосинтезированных цепей, ограниченная праймером с одной стороны, имеет большую длину, чем расстояние между праймерами. Такие цепи называют «длинными матрицами». Во втором раунде матрицами служат исходная и новосинтезированная ДНК.
Рис. 14. Полимеразная цепная реакция [https://www.ncbi.nih.gov/book/ Molecular Cell Biology /recombinant DNA and Genomics]
Образуются как «длинные», так и «короткие матрицы», которые ограничены с двух сторон заданными праймерами. В третьем и последующих раундах
«коротких матриц» становится все больше и к 30-му раунду их число уже в 106 раз превышает число исходных цепей. За 20-30 циклов количество копий гена увеличивается в 106-109 раз.
Первоначально для ПЦР использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Однако после каждого цикла необходимо было вносить в реакционную смесь новую порцию фермента. Решающим фактором для развития ПЦР стало открытие термостабильной ДНК-полимеразы, способной выдерживать многократные нагревания и охлаждения. Это Tag -полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus. С использованием этого фермента отпала необходимость добавлять фермент после каждого цикла реакции. Это позволило автоматизировать процедуру. Реакцию проводят в программируемом термостате, где смена температур происходит автоматически. На один цикл уходит от 3 до 5 мин. Сейчас стали применять Pfu -полимеразу из архебактерий Pirococcus furiosus, живущих в морских кратерах при 100оС. Фермент проводит синтез корректнее, чем Tag -полимераза.
Полимеразная цепная реакция позволяет также амплифицировать молекулы РНК. На первом этапе с помощью обратной транскриптазы (ОТ) получают ДНК-копию целевой РНК, а затем осуществляют ПЦР. Метод называется ОТ- ПЦР. На основе ПЦР в 1988 г. А.Белявский и К. Раевский предложили способ амплификации молекул кДНК in vitro. Чтобы молекулы кДНК могли участвовать в амплификации, необходимо наличие общих последовательностей на обоих концах всех молекул кДНК. Первая реакция будет инициироваться поли(Т)-праймером, комплиментарным поли(А)-последовательности мРНК. После синтеза первой цепи кДНК к ее 3’-концу с помощью терминальной трансферазы достраивают олиго(dG)-конец. РНК из образованного дуплекса удаляют щелочным гидролизом, после чего одноцепочечная матрица готова к амплификации с использованием двух праймеров: (Т)- и (G)-олигонуклеотидов.
Так на основе суммарной мРНК были сконструированы представительные библиотеки кДНК.
Другая разновидность ПЦР заключается в одновременной амплификации сразу нескольких генетических локусов. В этом случае используют более одной пары олигонуклеотидных праймеров. Такая реакция получила название мультиплексная ПЦР (МПЦР).
Олигонуклеотидные микрочипы. Метод олигонуклеотидных микрочипов (microarray) разработан акад. А.Мирзабековым. Олигонуклеотиды с известной последовательностью иммобилизуют на твердом носителе в строго определенном порядке и получают микрочипы - микроматрицы, содержащие на небольшой поверхности в несколько см2 тысячи индивидуальных проб для последующей гибридизации. Исследуемые препараты ДНК, предназначенные для гибридизации на микрочипе, флуоресцентно метят, обычно в процессе ПЦР. После гибридизации и отмывки микрочип анализируют с помощью лазерного сканера. Данные флуоресценции каждой ячейки микрочипа подвергают компьютерной обработке с программным обеспечением. Секвенирование многочисленных кДНК и полных геномов создало базу для получения микрочипов, позволяющих одновременно изучать экспрессию большого числа генов на уровне целого генома. Были созданы микроматрицы с нанесенными в строгом порядке образцами ПЦР-фрагментов кДНК для тысяч генов человека и других организмов. Часто создают специализированные микрочипы для анализа экспрессии определенных типов генов: контролирующих клеточный цикл, апоптоз, трансляцию, факторы транскрипции и др. Например, Т.Шенк с сотрудниками (1998 г.), используя четыре микрочипа, содержащих в сумме фрагменты кДНК для 6600 генов человека, изучили, как инфицирование вирусом человека влияет на экспрессию этих генов. Оказалось, что вирусная инфекция (цитомегаловирус) изменяет экспрессию 258 генов. Технология ДНК-микрочипов рассматривается как наиболее перспективная в диагностической практике. Будут созданы микроматрицы для одновременного выявления большинства известных
инфекций (вирусов, бактерий, простейших и т.д.). Проведение такого масштабного экспресс-анализа другими методами невозможно.
ПЦР в реальном времени или количественный ПЦР – метод основан на полимеразной цепной реакции с одновременным измерением количества вновь синтезируемых молекул ДНК. Определение выхода продукта ПЦР осуществляется после каждого цикла амплификации. По данным строится кинетическая кривая, которая позволяет определить относительную концентрацию ДНК. Используют два подхода: применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, свечение которых возрастает при связывании с дцДНК и использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку PCR-продукта. Интеркалирующий краситель связывается с дцДНК и вызывает свечение, которое регистрирует прибор. В технологиях TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler используют меченые олигонуклеотидные пробы. Принцип TaqMan основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности ДНК полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды с флуоресцентной меткой в 5'- положении и гасителем флуоресценции в 3'-положении. При отжиге праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК (Рис. 15).
 |
Рис. 15. Схема ПЦР в реальном времени по технологии TaqMan: R- флуоресцентный краситель, Q- гаситель.
Во время элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря 5'-экзонуклеазной активности. Происходит разъединение метки и гасителя, что приводит к увеличению свечения.
Принцип Molecular Beacons отличается от TaqMan тем, что концы пробы, на которых находятся метка и гаситель флуоресценции комплементарны друг другу. При температуре отжига праймеров они комплементарно взаимодействуют, зона комплементарности находится в петле (Рис. 16).
 |
Рис. 16. Схема ПЦР в реальном времени по технологии Molecular Beacons.
При гибридизации пробы с матрицей вторичная структура разрушается, метка и гаситель расходятся и определяют уровень флуоресценции.
LightCycler отличается повышенной специфичностью, увеличение флуоресценции происходит при связывании с ДНК сразу 2-х зондов (Рис. 17).
 |
Рис. 17. Схема ПЦР в реальном времени по технологии Light Cycler
Принцип метода в переносе энергии от метки первого зонда на метку второго, расстояние между которыми 1-3 нуклеотида. При связывании зондов с ДНК матрицей излучение, испускаемое первым флуорофором передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором.
На кривой, которая описывает процесс амплификации, выделяют три стадии (рис. 18): Экспоненциальная (в каждом цикле происходит удвоение продукта), линейная: компоненты реакции расходуются, реакция замедляется, и продукты начинают разрушаться, плато: реакция остановилась, продукты больше не синтезируются. В течение экспоненциальной фазы процесс отражает количество синтезированной последовательности. Как только условия амплификации лимитируются (инактивация фермента, наличие ингибиторов – пирофосфатов, обедненность буфера) кривая выходит на плато. Именно в этих условиях определяется количество продуктов реакции в условиях гель- электрофореза.
 |
Рис. 18. Кривая амплификации ДНК в режиме реального времени. Описание в тексте.
Направленный мутагенез молекул ДНК in vitro
Делеции и вставки. Доступный и часто используемый метод получения делеций – расщепление молекулы ДНК рестриктазой, которая имеет более одного участка узнавания, с последующим лигированием расщепленного
препарата ДНК. При этом часть молекул ДНК будет укорочена в результате выщепления одного или нескольких рестрикционных фрагментов.
Другой метод получения делеций in vitro – расщепление ДНК в определенном участке рестриктазой с последующей обработкой экзонуклеазой, которая гидролизует молекулу ДНК с обоих концов. Так получают наборы более коротких линейных молекул, которые после лигирования дают наборы кольцевых ДНК с делециями.
Встраивание (инсерция) экзогенной ДНК (природной или синтетической) осуществляют после получения случайных или направленных двухцепочечных разрывов. Разрывы получают путем кратковременной обработки панкреатической ДНКазой или рестриктазой. Затем проводят лигирование гетерологичных ДНК. Так был получен первый гибридный фаг М13.
Вводя делеции или инсерции in vitro можно изучать функции индивидуальных генов. На этом принципе основан метод генного нокаута. Протяженные делеции или инсерции в кодирующей области гена обычно приводят к нарушению рамки считывания и нарушают экспрессию гена.
Олигонуклеотид-направленный (сайтспецифический мутагенез) in vitro. Метод был разработан для одноцепочечной кольцевой ДНК фагов известной последовательности. Одноцепочечную ДНК гибридизуют с синтетическим олигонуклеотидом, несущим генетические модификации по сравнению с исходной последовательностью, например, точечную замену одного из нуклеотидов. Олигонуклеотид используется в качестве инициирующего праймера для синтеза второй цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Полученную двухцепочечную ДНК обрабатывают нуклеазой S1 для гидролиза двухцепочечных молекул и ими трансфецируют клетки E. coli. При репликации образуются фаги как дикого типа, так и мутантные. Метод получил дальнейшее развитие для нитевых фагов и плазмид. При этом плазмидную ДНК необходимо перевести в одноцепочечную кольцевую форму. Для точечной замены праймер должен содержать до двух-трех комплементарных нуклеотидов на 3’-конце и шести-семи – на 5’-конце от некомплементарного
нуклеотида. Если участок модификации увеличивается, размер синтетического олигонуклеотида возрастает. Поскольку ДНК-полимераза не всегда эффективно достраивает вторую цепочку ДНК, применяют метод с использованием двойных праймеров, либо кольцевой двухцепочечной ДНК с одноцепочечной брешью. При этом увеличивается выход синтезированных молекул двухцепочечной ДНК.
Появление ПЦР значительно упростило процедуру введения мутаций в последовательность ДНК. С помощью программ рассчитываются последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые содержат не только точечные мутации, но позволяют одновременно вводить участки узнавания рестриктаз, необходимые для запланированной встройки в клонирующий вектор. На введении в последовательность участков узнавания рестриктаз основана технология кассетного мутагенеза. В непосредственной близости от предполагаемого места введения мутации с 5’- и 3’-стороны олигонуклеотид-направленным мутагенезом вводят сайты узнавания рестриктаз. Полученную плазмиду гидролизуют и добавляют смесь синтетических двухцепочечных сегментов, которые после встройки восстанавливают последовательность гена, за исключением триплета, кодирующего определенную аминокислоту. После трансформации клеток бактерий E. coli секвенированием идентифицируют плазмиды, содержащие замены данного триплета.
Такой подход был реализован для введения сайтспецифичных мутаций в ген субтилизина B. subtilis. Путем кассетного мутагенеза получили 19 вариантов субтилизина, у которых Met222 был замещен всеми другими аминокислотами. Оказалось, что единичная замена Met222 на другие аминокислоты приводит к вариациям в ферментативной активности от 0,3 до 138% от уровня удельной активности нативного фермента. Замена Met222 на Ala, Ser, Cys значительно повышает устойчивость субтилизина к воздействию химических окислителей. Таким образом, методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза можно создавать ферменты, имеющие повышенную удельную активность,
термостабильность, устойчивость к окислительной инактивации, а также измененную специфичность взаимодействия с макромолекулами. Это имеет особое значение для практического использования бактериальных ферментов.
Многие белки эукариот, клонированные в бактериальных векторах, имеют доменную структуру. Введение сайтов рестрикции в участки гена, фланкирующие отдельные домены, позволяют менять эти домены на гетерологичные, т.е. конструировать белки с новыми свойствами.
Другой подход для создания новых белков – получение гибридных генов, кодирующих гибридные (химерные) интерфероны. Методами генной инженерии созданы многочисленные суперпродуценты интерферонов человека. Эти препараты и их смеси интенсивно используются в медицине для модуляции иммунного ответа организма. Оказалось, что гибридные формы имеют значительно большую антивирусную активность по сравнению с исходными формами. Разработан метод, позволяющий получать гибридные гены интерферона, которые образуются в результате рекомбинации клонированных генов in vivo. Были использованы гены мышиных интерферонов альфа-1 и альфа-4. Эти белки различаются по последовательности лишь на 20% и имеют существенные отличия по противовирусной активности. Оба гена встраивали в одну векторную плазмиду, переводили в линейную форму и трансформировали в клетки E. coli recA+. После рекомбинации отбирали гибридные плазмиды. Области кроссинговера в гибридных плазмидах устанавливали с помощью рестрикционного анализа. Некоторые из гибридных интерферонов имели противовирусную активность гораздо более высокую, чем исходные белки. Таким образом, данное направление исследований перспективно для медицинской и ветеринарной практики.
Успехи в разработке методов направленного мутагенеза привели к тому, что эти процедуры могут применяться практически в любой молекулярно- биологической лаборатории. Эти методы стали неотъемлемой частью современных исследований в различных областях биологии.
Геномы микроорганизмов
Разработка информационных технологий, методов клонирования и секвенирования создали базу для определения нуклеотидных последовательностей крупных молекул ДНК хромосом. В 1978 г. Ф.Сэнгер с соавторами впервые опубликовали первую полную последовательность бактериофага fX174 (5386 пн). Вслед за этим были секвенированы геномы различных бактериофагов и вирусов. В 1995 г. секвенирован первый бактериальный геном хромосомы Haemophilus influenzae (Табл. 2).
Таблица 2. Геномы патогенных микроорганизмов
| Организм | Вызываемое заболевание | Размер генома, млн пн | Год публикации |
| Haemophilus influenzae | Менингит, пневмония | 1,8 | |
| Mycobacterium tuberculosis | Туберкулёз | 4,4 | |
| Campylobacter jejuni | Диарея | 1,6 | |
| Escherichia coli 0157 | Пищевое отравление | 5,5 | |
| Vibrio cholerae | Холера | 4,0 | |
| Mycobacterium leprae | Проказа | 3,3 | |
| Neisseria menigitides | Менингит | 2,3 | |
| Chlamydia pneumoniae | Пневмония | 1,23 | |
| Streptococcus pneumoniae | Пневмония | 2,2 | |
| Yersinia pestis | Чума | 4,7 | |
| Salmonella typhi (CT18) | Брюшной тиф | 4,5 | |
| Brucella melitensis | Бруцеллез | 3,3 | |
| Shigella flexneri | Дизентерия | 4,6 | |
| Bacillus anthracis | Сибирская язва | 4,5 | |
| Legionella pneumophila | Легионелез | 3,5 | |
| Bacillus cereus | Токсикоинфекции | 5,3 | |
| Yersinia pseudotuberculosis | Псевдотуберкулез | 4,8 | |
| Streptococcus pyogenes | Скарлатина, гноеродные инфекции | 1,9 | |
| Neisseria gonorrhoeae | Гонорея | 2,1 | |
| Pseudomonas fluorescens | Гноеродные инфекции | 6,4 | |
| Aspergillus oryzae | Грибковая инфекция | ||
| Aspergillus fumigatus | Грибковая инфекция | 29,3 | |
| Rickettsia bellii | Сыпной тиф | 5,065 | |
| Staphylococcus aureus | Гноеродные инфекции | 2,9 |
Геном характеризовался низким содержанием GC пар (38%). Из 1743 открытых рамок считывания 736 - гены с неизвестной функцией. 78% ORF H. influenzae имеют гомологию с генами других организмов. В 1997 г. усилиями мирового сообщества секвенирован геном E. coli К-12 (4639221 пн). Содержание GC-пар составило 50,8%. 87,8% генома занимают белок- кодирующие гены, 0,8% - гены, кодирующие РНК, 0,7% - некодирующие повторы. Анализ выявил 4288 потенциальных ORF, из которых 38% кодируют белки с неизвестной функцией. Стартовыми кодонами являются ATG (3542 ORF), GTG (612), TTG (130). Частота встречаемости терминирующих триплетов: TAA (2705), TGA (1257), TAG (326). Для 405 генов показано перекрывание стартового и терминирующего триплетов.
Секвенирование полного генома B. subtilis 168 осуществлено в 1997 г. Размер генома – 4214814 пн, геном содержит 4290 генов, содержание GC-пар – 43,5%.
Развитие геномных проектов прокариот направлено, прежде всего, на секвенирование и анализ геномов патогенных микроорганизмов (Табл. 1) и вирусов. Такая информация является приоритетом современной геномики. Эти данные способствуют формированию наших знаний о взаимодействии двух геномов, генома патогена и генома клетки-хозяина, что позволит выявить защитные механизмы, которые формируются в организме в ответ на конкретную инфекцию. С другой стороны, накапливаются данные о молекулярных механизмах патогенного действия микроорганизмов. На основе этих знаний с помощью методов генной инженерии, протеомного анализа и информационных технологий ожидается разработка диагностикумов и препаратов нового поколения для лечения различных инфекционных заболеваний. В последние годы широкую значимость приобрели проекты по метагеномному секвенированию, которые позволяют выяснить весь арсенал живых организмов, сосуществующих в определенной экологической нише и определить пути их взаимодействия.