Цель занятия. Закончив изучение темы, студенты должны знать:
- особенности гемопоэза и его регуляции в возрастном аспекте;
- изменения эритрограммы в возрастном аспекте;
- изменения лейкограммы в возрастном аспекте;
- показатели коагулограммы в возрастном аспекте;
- технику проведения и оценки биопсии лимфоузла, миелограммы, коагулогаммы,
- современные инструментальные методы исследования лимфоузлов (рентгенограмма, компьютерная томография и др.)
Студенты должны уметь:
- провести опрос, выяснив возможные жалобы со стороны органов кроветворения, причины, влияющие на гемопоэз;
- провести осмотр и пальпацию лимфоузлов;
- провести осмотр, пальпацию, перкуссию селезенки;
- оценить гемограмму, миелограмму, коагулогамму ребенка разного возраста;
Краткое изложение теоретического материала.
Понятие о гемопоэзе. Самым первым предшественником клеток крови является примитивная стволовая кроветворная клетка – пСКК или гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК). Вторым членом отдела стволовых клеток является клетка, обеспечивающая поддержание кроветворения в длительной культуре костного мозга. Эта клетка способна поддерживать процессы кроветворения в культуре не менее 5-7 недель. Более зрелыми полипотентными предшественниками являются клетки, получившие образное название клеток, образующих области булыжника, – КООБ. Такое наименование они приобрели потому, что под микроскопом напоминают булыжную мостовую. Предполагается, что наиболее ранние из этих предшественников требуют для образования областей булыжников от 5 до 8 недель (КООБ5). Следующая полипотентная клетка, выявляемая в культуре, – КООБ2. Эта клетка образует булыжник в культуре за 10-12 дней. Ещё более зрелым предшественником является КОЕ-с8 – клетка, способная образовывать колонии в селезёнке за 7-8 дней после трансплантации. Все эти предшественники образуют отдел мультипотентных стволовых клеток. Их характеризует постепенное увеличение пролиферативной активности по мере созревания и увеличение абсолютного и относительного содержания в кроветворных тканях.
Следующие члены кроветворной иерархии объединены в отдел олигополипотентных коммитированных клеток (они называются коммитированными, ибо ограничены в выборе возможных дифференцировок), дающих начало полипотентным колониеобразующим единицам (КОЕ). В этот отдел входят предшественники миело- и лимфопоэза. В настоящее время установлено, что существует общий предшественник Т- и В-лимфоцитов, а также натуральных киллеров (NK-клеток). В отдельную линию дифференцировок выделены и профессиональные антигенпрезентирующие дендритные клетки. Последние имеют двойное происхождение – миелоидное (из общего миелоидного предшественника) и лимфоидное (из общего лимфоидного предшественника).
В отдел олигопотентных коммитированных клеток входит несколько предшественников. Первый из них – клетка, образующая в культуре колонии бластных клеток – КОЕбл. За 3-4 недели они образуют небольшие колонии, состоящие приблизительно из 300-400 недифференцированных бластов. КОЕбл среди этого отдела клеток обладают наибольшим пролиферативным потенциалом. Очень близок к КОЕбл другой предшественник – колониеобразующая единица высокого пролиферативного потенциала – КОЕ-ВПП. Эта клетка в культуре даёт огромные, до 1-2 мм в диаметре колонии макрофагов. КОЕ-ВПП полипотентна и способна к реклонированию.
Следующим полипотентным предшественником является клетка, дающая смешанные колонии, состоящие из эритроцитов, гранулоцитов, мегакариоцитов и макрофагов, – ГЭММ-КОЕ. Эта клетка способна дифференцироваться по всем направлениям миелопоэза. В этом же отделе располагаются и предшественники, более ограниченные в возможностях дифференцировки, чем ГЭММ-КОЕ. Здесь же выявляются клетки, направление дифференцировки которых в дальнейшем предопределено, но при этом выбор происходит любым случайным образом из всех возможных теоретических комбинаций. Здесь имеются предшественники, способные к дифференцировке в эритроциты и мегакариоциты, в эритроциты и гранулоциты, мегакариоциты и гранулоциты, то есть возникают 2 – 5-потентные КОЕ в любом наборе (за исключением лимфоцитов). В дальнейшем они превращаются в унипотентные (монопотентные) коммитированные клетки, т. е. становятся предшественниками, которые дают начало морфологически распознаваемым клонам, иными словами, дифференцируются только в одном направлении.
Регуляция гемопоэза. Все без исключения предшественники способны к размножению только при наличии специальных стимулирующих факторов, образуемых преимущественно моноцитами, макрофагами, лимфоцитами, эндотелиальными клетками и стромальными элементами костного мозга и получивших наименование цитокинов. В настоящее время обнаружен целый ряд специфических цитокинов, влияющих на процессы кроветворения и обеспечивающих развитие того или иного клона клеток на поздних стадиях их формирования. К таким биологически активным соединениям относятся фактор эритропоэза – эритропоэтин, тромбоцитопоэза – тромбопоэтин и фактор роста и развития мегакариоцитов ( Mg-CSF), фактор, влияющий на развитие макрофагов и моноцитов, – макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-СS F) и другие. Известны также факторы, действующие на ранних этапах кроветворения. Это так называемый белковый фактор стила SCF (от английского слова steel – стальной) или, иначе, фактор стволовых клеток (ФСК), и лейкозингибирующий фактор ( LIF), способные оказывать влияние непосредственно на СКК и стволовые мультипотентные клетки, вызывая их пролиферацию и переход в полиолигопотентные коммитированные клетки. Эндотелиоцитами сосудов костного мозга вырабатывается Kit-лиганд, обеспечивающий взаимодействие стромы со стволовыми клетками, что является одним из важнейших факторов нормального гемопоэза. Кроме того, на пСКК действуют и другие цитокины, получившие наименование интерлейкины ( IL ), и так называемые ростовые факторы. На пСКК оказывают влияние IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, IL-12, а также гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ( G-CSF). На полиолигопотентные коммитированные предшественники оказывает влияние IL-З и G-СSF, после чего появляется комплекс колониеобразующих единиц, объединяющий от 2 до 5 КОЕ в любых наборах. Значительная роль в гемопоэзе отводится IL-B30, способному оказывать влияние на созревание различных гемопоэтических клеток предшественников, в том числе Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, моноцитов, макрофагов и других. Т- и В-лимфоцитов образуются из какого-либо предшественника стволовых мультипотентных клеток, на эти клетки действует IL-1, в результате чего они могут превращаться в пре-Т- и пре-В-лимфоцит.
Часть крови, которой снабжается костный мозг, проходит через костную ткань, где она может обогащаться физиологически активными веществами, в том числе колониестимулирующими факторами, гликозамингликанами, ионами кальция и другими.
Не последнюю роль в гемопоэзе играет лиганд FLK-2 (fetal liver kinase-2), вырабатываемый эндотелиальными клетками сосудов костного мозга, стимулирующий пролиферацию CD34-гемопоэтических клеток и их дифференцировку в эритроидном и миелоидном направлениях.
Наконец, фактор роста эндотелия сосудов А – VEGF-A (vascular endothelial growth faktor A) влияет не только на ангиогенез, но и является важнейшим регулятором гемопоэза.
Механизм действия ростовых факторов на процессы кроветворения был изучен только в последнее время с открытием ферментов (тирозинокиназ), относящихся к семейству Janus активированных киназ – JAK - 1, JAK-2, JAK-3, Tyk-2. Оказалось, что при взаимодействии ростового фактора с клеткой происходит полимеризация рецептора, что сопровождается полимеризацией JAK. Последние действуют на так называемые сигналпередающие и активирующие транскрипцию молекулы, вызывая их фосфорилирование и способствуя образованию гомо- или гетеродимеров.Димеризованные STAT-молекулы попадают в ядро и связываются со строго специфическими участками молекулы ДНК, благодаря чему наступает экспрессия определённых генов. Активация JAK-молекул бывает временной, что и регулирует интенсивность процессов кроветворения. Окончательная реакция на цитокинростовый фактор определяется активированными JAK-киназами и STAT-белками и состоит в пролиферации, дифференцировке и созревании клеток. Установлено, что G-CSF, повышающий пролиферацию и дифференцировку клеток нейтрофильного ряда, оказывает своё воздействие через JAK-1-киназу. В то же время JAK-3 – цитоплазматическая тирозинкиназа вступает во взаимосвязь с рецепторами к IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15 и влияет на образование клеток лимфоидного и миелоидного ряда. Недостаток JAK-3 сказывается на развитии гранулоцитов, Т-, В-лимфоцитов и NK-клеток.
Важная роль в процессе гемопоэза отводится «костномозговому окружению», включающему следующие компоненты: 1. экстрацеллюлярная матрица – в неё входят коллагены типа I, III, IV и V, фибронектин, ламинин, гликопротеины, протеогликаны; 2. стромальные клетки костного мозга; 3. биологически активные соединения, в том числе цитокины, адгезивные молекулы и др. Клетки микроокружения образуют специфические «ниши», поддерживающие тесную связь с находящимися в них СКК, и оказывают существенное влияние на их дифференцировку и развитие.
Наряду со стимуляторами существуют и ингибиторы процесса кроветворения. Угнетение гемопоэза осуществляется различными путями: 1. за счёт секреции различными клетками ингибирующих цитокинов; 2. в результате цитотоксического действия макрофагов, CTL и NK-лимфоцитов; 3. благодаря секреции ингибиторных факторов пролиферации зрелыми, угнетающими развитие этих же клеток (нейтрофилы, моноциты, тромбоциты). К числу ингибиторов роста и дифференцировки гемопоэтических клеток относятся TGFβ, IL-4, IL-8, IL-10, TNFβ, интерфероны, фактор, выделяемый стромой костного мозга, некоторые простагландины, лактоферрин, ферритин, а также димерные гликопротеины, получившие наименование ингибины. Следует также обратить внимание на то, что отдельные ростовые факторы, стимулируя развитие клеток одного гемопоэтического ростка, способны угнетать рост и дифференцировку другого. Так, IL-3 и GM-CSF способны угнетать развитие эритроидных клеток.
В то же время как положительные, так и отрицательные регуляторы процесса кроветворения действуют согласованно и тем самым быстро обеспечивают организм теми клетками, в которых он в конкретной ситуации больше всего нуждается.
Кроветворные клетки в костном мозге, как и клетки-предшественники, собраны в гроздья, окруженные фибробластами и эндотелиальными клетками. Созревая, клетки должны пробить себе путь в синусы, откуда они затем вымываются в венозную кровь. Миграция гемопоэтических клеток-предшественников представляет собой многофакторный процесс, регулируемый в значительной степени состоянием эндотелия костномозговых микрососудов. В этом процессе принимают участие молекулы семейства β2-интегринов. Вместе с тем, активированные фактором роста кроветворные клетки способны образовывать цитокины, воздействующие на эндотелий, и в частности, сосудистый эндотелиальный фактор роста – VEGF, в результате чего у эндотелиоцитов изменяется размер, подвижность и способность образовывать отверстия (фенестры). В настоящее время доказано, что поступление эритроцитов и лейкоцитов из костного мозга в циркуляцию регулируется тремя видами клеток, составляющих вместе «костномозговой барьер ». Он включает в себя макрофаги, локализованные вокруг венозных синусов (перисинуальные макрофаги), адвентициальные ретикулярные клетки и синусовые эндотелиоциты.
Для того чтобы «пробить» себе путь из костного мозга в кровь, форменные элементы должны обладать достаточной деформируемостью. Выход ретикулоцитов через эндотелий происходит в большинстве случаев не между клетками, а через клетки. Эта миграция связана с образованием пор в эндотелиальных клетках и появлением микронитей вокруг этих отверстий. Максимальный диаметр таких пор не превышает 4 мкм, что приблизительно соответствует размеру выходящих эритроцитов. Несозревшие клетки – эритробласты, миелобласты, промиелоциты – содержат ядра, обладающие ригидностью, а потому не могут пройти через эти отверстия в эндотелиальных клетках костномозговых синусов. В то же время ядра зрелых клеток легко деформируются, благодаря чему они легко изменяют свою форму и без труда преодолевают барьеры на пути в циркуляцию.
Однако окружение костного мозга служит не только препятствием для выхода форменных элементов в общий кровоток. Ячейки, образованные фибробластами и эндотелиальными клетками в гроздьях костномозговых клеток, являются важнейшей частью кроветворного механизма. Так, если поместить эритроидные предшественники на ячеистую сеть костномозговых фибробластов, то клетки предшественники быстро развиваются и втискиваются между фибробластами, так как для их дифференцировки требуется плотная адгезия (прикрепление к поверхности) с окружением. Для адгезии же необходим особый белок – фибронектин, который связывает клетки предшественники с помощью особых рецепторов с поверхностью фибробластов и эндотелиальных клеток. Если такой адгезии нет, то пролиферация и дифференцировка клеток ингибируется. Кроме того, фибробласты и эндотелиальные клетки являются важнейшим источником ростовых факторов кроветворения.
Особенности гемопоэза у ребёнка. Первоначально костный мозг возникает в конце второго месяца у эмбриона в ключице, а в телах позвонков он появляется у 13-недельного плода. К этому же сроку в подвздошной, в диафизах плечевой и бедренной кости выявляются незрелые гемопоэтические клетки и эритроциты. В последующие месяцы внутриутробного развития эмбриона общий объём костного мозга быстро увеличивается, достигая максимума к 30 неделе гестации. В последние десять недель внутриутробного развития плода общая масса костного мозга практически не изменяется. В возрасте 23-27 недель у плода выявляются элементы всех трёх ростков кроветворения на всех стадиях развития.
Вначале костный мозг заселяют мезенхимные костномозговые клетки, поступающие из желточного мешка, из которых впоследствии образуются клетки, морфологически сходные с гемоцитобластами печени и желточного мешка. Аналогично последним они дают начало не только эритроидным клеткам, но и мегакариоцитам, а также миелоидному ростку. Более того, миелопоэз в костном мозге развивается раньше эритропоэза.
Медуллярный эритропоэз развивается экстраваскулярно вне синусов, в строме костного мозга. Зрелые клетки поступают в ток крови путём диапедеза через стенки синусов костного мозга.
У доношенного новорожденного ребёнка общий объём костного мозга колеблется от 16 до 44 мл, а по отношению к массе тела составляет в среднем 1,4%, что значительно меньше, чем у взрослого (в среднем 4,6%). Вот почему у детей первого года жизни при целом ряде патологических состояний, когда происходит усиленное разрушение клеток крови на периферии, нет возможности увеличить их продукцию за счёт мобилизации его резерва в костном мозге. При этом очаги кроветворения возникают в других органах (печени, селезёнке), и происходит возврат к эмбриональному типу кроветворения.
Начиная с четырехлетнего возраста у детей наступает инволюция костного мозга: в диафизах длинных трубчатых костей появляются жировые клетки и нарастает объём полостей. В дальнейшем этот процесс постепенно нарастает и к 16-18 годам костный мозг сохраняется только в телах позвонков, грудине, костях таза и черепа, а также в проксимальных частях плечевых и бедренных костей. Однако общая масса костного мозга у ребенка в возрасте 2-3 лет и у взрослого человека приблизительно одинакова и вполне достаточна, чтобы обеспечить процессы нормального кроветворения.
После рождения ребёнка и до глубокой старости процессы кроветворения осуществляются исключительно в костном мозге. Разумеется, характер миелограммы (клеточного состава пунктата костного мозга) с возрастом претерпевает существенные изменения (табл. 29).
Таблица 29