Следует отметить, что некоторые гены, кодирующие ферменты, участвующих в биосинтезе амилопектина и других в гликолизе являются РАЗРАБОТКА-подсчет регулируется во время тахизоит к брадизоитному преобразованию ступени (см главу 13 для обсуждения брадизоитный дифференциации).
8.2.4.1 Стадия-специфическая экспрессия генов, участвующих в деградации амилопектина
Паттерн экспрессии генов, вовлеченных в биосинтезе амилопектина в тахизоитах и bradyzoites, выделенные из цистого мозга мыши был исследован с помощью RT-PCR. Транскрипты, кодирующие ферменты, как известно, участвует в катаболических функций, таких как белок R1,αглюкана фос-phorylase, αглюкозидазы и αамилазы, являются прив-erentially выражается в bradyzoites (Коппины и др., 2005). Контраст во, транскриптах, кодирующие ферменты, как известно, участвуют в синтезе амилопектина (glycogenin, амилопектин-синтазах, ветвление фермента) преимущественно выражены в тахи- zoites, но также могут быть обнаружены при более низких уровнях экспрессии в bradyzoites.
Эта модель согласуется с производством амилопектина во время дифференцировки тахизоитов в bradyzoites, и с мобилизацией магазинов глюкозы во время брадизоитного к тахизоит взаимопревращение (Tomavo, 2001). Несмотря на то, есть данные для транскрипции этих генов, еще предстоит определить, является ли транскрипты, обнаруженные переведены на функциональные белки и ферменты. Таким образом, специфические антитела или ферментативные активности должны быть проверены для того, чтобы продемонстрировать синтез протеина. Даже если enzy-Matic активность синтазов амилопектина была продемонстрирована в обеих тахизоитах и bradyzoites (Коппины и др., 2005), пост-транскрипционный регулиров-ние может также происходить на некоторых стадии специфических транскриптов обнаружено.
8.2.4.2 Стадии-специфической экспрессии генов, участвующих в гликолизе
Глюкоза-6-фосфат изомераза и лактат dehy-drogenases Гликолитический фермент лактат dehy-drogenase (ЛДГ, EC 1.1.1.27) является гликолитическим ферментом, который катализирует взаимопревращение пирувата в лактат с использованием НАД + в качестве кофермента (рис 8.3). Два этап специфических генов ЛДГА, были идентифицированы-Fied; тахизоит конкретных LDH1 и брадизоитный конкретных LDH2 (Янг и Parmley, 1995, 1997). Транскрипт LDH2 был обнаружен только в стадии брадизоитной, тогда как мРНК LDH1 был найден в обеих брадизоитных и тахах-zoite этапов. Отсутствие мРНК LDH2 в тахизоит предполагает, что транскрипция LDH2 подавляется при переходе от Brady-zoite до стадии тахизоит. С другой стороны, данные указывают на то, что LDH1 является единственным изоферментом производится с помощью тахизоитов. Уровень мРНК LDH2 заметно увеличилась в пробирке во Brady-zoite индукции, предполагая, что транскрипция ACTi-vation и / или стабильность мРНК может объяснить экспрессию гена LDH2 в T. гондий (Yang и Parmley, 1997) стадия конкретных. Поскольку предсказанные изоэлектрические точки два LDHs различны, двумерный электрофорез был использован, чтобы показать, что только один ЛДГ белка экспрессируются в каждой стадии развития паразитной.
Кроме того, было показано, что LDH1 и LDH2 разделяют уникальную структурную особенность с ЛДГ от малярийного паразита Plasmodium Falci-parum (pLDH), а именно пять-аминокислоты INSER-ции в контур субстратной специфичности. Эта вставка наблюдалась только в pLDH, LDH1 и LDH2 (Bzik и соавт, 1993;. Янг и Parmley, 1997). Все другие ферменты ЛДГА, описанные до сих пор не содержат эту вставку. Вставки в LDH2 идентична вставки в pLDH (KSDKE), но немного отличается от вставки в LDH1 (KPDSE).
Сравнительные исследования кинетических свойств Т. гондий LDH1 и LDH2 и П. трехдневной ЛДГ показали, что LDH1 и LDH2 экспозиционной специфичность шире, чем субстрат pLDH. Для обоих LDH1 и LDH2, 3-phenylpyruvate является отличным субстратом - даже лучше, чем пируват, когда LDH2 был протестирован
| БИОХИМИЯ И ОБМЕН токсоплазма | ||||||
| глюкоза | ||||||
| Гексокиназа | ATP | |||||
| фосфоглюкомутазы | АДФ | |||||
| Глюкоза 1-фосфат | Глюкоза-6-фосфат | |||||
| UDP-глюкозы | UTP | фосфоглюкозы изомеразы | ||||
| пирофосфорилазы | PPi | |||||
| Фруктоза 6-фосфат | ||||||
| UDP-глюкозы | ||||||
| ATP | ||||||
| Glycogenin, амилопектина | Фосфофрукто-киназа | |||||
| синтазы, ветвление ферментов, | АДФ | |||||
| Фруктозо-1,6-дифосфат | ||||||
| непрямой деветвящий фермент | ||||||
| альдолазы | ||||||
| амилопектина | Триозофосфатизомеразы | |||||
| глицеральдегид 3- | Dihydroxyacetone | |||||
| фосфат | ||||||
| фосфат | ||||||
| NAD++ Pi | ||||||
| Глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы | ||||||
| НАДН + Н+ | ||||||
| 1,3-Bisphosphoglycerate | ||||||
| фосфоглицераткиназы | АДФ | |||||
| ATP | ||||||
| 3-фосфоглицерат | ||||||
| фосфоглицеромутаза | ||||||
| 2-фосфоглицерат | ||||||
| енолаза | ЧАС2О | |||||
| фосфоэнолпируват | ||||||
| пируват киназы | АДФ | |||||
| ATP | ||||||
| пируват |
лактат дегидрогеназы 
НАДН + Н+
NAD+
L-лактат
РИСУНОК 8.3 Схематическое изображение связи между гликолиза и биосинтез амилопектина. Классический путь гликолиза показан на правой панели. Фосфоглюкозоизомераза изомеразы, енолаза и лактатдегидрогеназы (показаны красным цветом, см цветовой пластине) находятся в виде двух изо-ферментов; каждый фермент представляет собой стадия, в частности, выражается в тахизоитах или в bradyzoites (подробнее см в тексте). Эта цифра воспроизводится в цвете в разделе Цвет пластины.
с обеими подложками. В отличие от этого, pLDH не
Различия в чувствительности к ингибиторам
используют 3-phenylpyruvate (Дэндо и др., 2001). В
между LDH1 и LDH2 дополнительно иллюстрируют, как
Кроме того, оба LDH1 и LDH2 могут использовать NAD
эти ферменты, возможно, развились, чтобы служить отдельным
аналоговый
3-ацетилпиридин
аденин
динуклеотидную
роли в процессе развития стадии. Так должно быть
(APAD) эффективно, по аналогии с pLDH. Диапазон
отметил, что эти исследования были проведены
ингибиторы включая госсипол и производные ингибируют
рекомбинантными ферментами. Эти наблюдения
LDH1, LDH2 и pLDH, но в целом LDH2 является
остается быть подтверждено с родными Очищенным
более чувствительны, чем LDH1. LDH1 также показывает
ферменты, так как могут быть и другие ко-факторы
Ингибирование субстрата, несмотря на замены в обоих
участвует в модуляции ферментативной правильно-
LDH1 и LDH2 из метионина для серина-163,
связей. Тем не менее, можно предположить, что
остаток, который, как полагают, является критическим для производства
очевидно, повысить чувствительность рекомбинантного LDH2
субстратного ингибирования (Дэндо и др., 2001). Наиболее
чтобы госсипол и его производные могут быть проводами для
важно, госсипола и gossylic iminolactone
Конструкция ингибиторов, которые могут быть использованы в качестве
Было показано, что ингибирование отображения Т. гондий
химиотерапевтические средства, чтобы исключить кисту из
тахизоит роста фибробластов культур.
хронически инфицированных хозяев.
| ОБМЕН УГЛЕВОДОВ |
Для этого может потребоваться кристаллическая структура ЛДГ. Кавана и др. (2004) кристаллизуют LDH1 в apoform и в его тройных комплексов, содержащих NAD + или НАД+ аналоговый 3-ацетилпиридин-аденин-динуклеотид (APAD (+)) И сульфат или ингибитор оксалата. Совмещение LDH1 с человеком мышц и сердце конкретного ЛДГА изоформом показывает различающуюся-ences в остатках, которые выстилают активный сайт. Это повышает гидрофобность LDH1 в. Был сделан вывод о том, что эти различия будут помогать в разработке ингибиторов, специфичных для LDH1, которые могут быть полезны при лечении токсоплазматического энцефалита и других осложнений, которые возникают у пациентов с иммунодефицитом.
Другой гликолитический фермент, который является стадия конкретным является глюкоза-6-фосфата-изомераза (О6-ПИ, ЕС 5.3.1.9), которая катализирует взаимопревращение глюкозы 6-фосфата в фруктозо-6-фосфата (рис 8.3). КДНК-фрагмент, кодирующий О6-ПИ был выделен из брадизоитного конкретных вычитательной библиотеки и кДНКа полной длины была использован в дополнении к палочке мутанта E. отсутствует G6-PI (Dzierszinski и соавт, 1999;.. Yahiaoui и соавт, 1999), Данные ОТ-ПЦР были показано, что расшифровка кодирования G6-PI преимущественно присутствует в Brady-zoites, а незначительное количество может быть обнаружено в тахизоитах. Вестерн-блот-анализ, проведенный с конкретными поликлональными антителами показал, G6-PI только в осумкованном bradyzoites, демонстрируя экспрессию G6-PI стадии специфичной в Т. гондиях. Остается определить, однако, ли другие гены, кодирующие предполагаемый О6-PI в настоящее время, описанных в геноме Toxoplasma соответствуют тахизоит конкретных G6-PI. Здесь только Т. гондий кДНК, кодирующая О6-ПИ была испытана в E.coli комплементации; его ферментативная активность с очищенным ферментом непосредственно не анализировала.
Enolases В гликолиза, енолаза или ENO (2-фосфо-D-глицерат гидролазы, ЕС 4.2.1.11) катализирует превращение 2-фосфо-глицерата к фосфоенолпирувата (рис 8.3). Что же касается ЛДГА, два этапа конкретных енолаза-кодирующих генов, были описаны (Dzierszinski и др., 1999). Эти два гена расположены на одной и той же хромосоме и разделены только межгенной
Последовательность 1,6 т.п.н.. Оба транскрипт и белки, соответствующий продукт гена по имени ENO1 только обнаружены в bradyzoites в то время как транскрипт и белок ENO2 в найдены в тахизоитах. был найден амино-кислоты идентичность между ENO1 и ENO2, чтобы быть 73 процента.
Интересно, что по сравнению с человеком и другим enolases Млекопитающих, оба enolases содержат вставку Pentapeptide: EWGYC в ENO2, и почти идентичен EWGWS мотив в ENO1 и енолазе из малярийного плазмодия (Read и др (Dzierszinski и др., 1999). 1994), соответствен-тивно. Кроме того, еще один дипептид EK / DK INSER-Тион был также найден в ENO1 и ENO2 Т. гондий и П. трехдневной енолазы. Совмещение модели трехмерной структуры ENO1 или ENO2 с тем, что человеком енолазы показало идеальный матч между их 3D-моделями на наличие двух дополнительных контуров, соответствующее пентапептид EWGWC и дипептид EK INSER Тион, соответственно, за исключением. Присутствие этих двух петель было также очевидно в P. малярийного и, что удивительно, в растительных enolases (Dzierszinski и др., 1999).
Функции этих двух петель были investi закрытого с помощью сайт-направленного мутагенеза пентапептида, дипептида, и обе петли в ENO1 рекомбинантных ферментов (Dzierszinski и др., 2001). Ферментативные свойства этих мутантных ферментов и дикого типа фермент демон-strated, что исключение из одного цикла EK не влияет на Kм фермента, но удаление обеих петель вызывает увеличение в 13 раз фермента Kм, Делеция пентапептида EWGWC дал пятикратное увеличение Kм по сравнению с значениями фермента дикого типа.
Кроме того, Км, ВМаксимум, Также сравнивали и температуры стабильность чистых рекомбинантных ENO1 и ENO2 ферментов. В то время как Kм значения совпадают, ENO1 и ENO2 дисплея различны VМаксимумсо значением в три раза выше, чем для ENO2 ENO1, предполагая, что два изоферментов имеют одинаковое сродство к подложке 2-ФГК, но проявляют различные скорости потребления субстрата. Было также установлено, температура денатурации ENO1, чтобы быть выше, чем у ENO2, что свидетельствует о том, что тахизоит ENO2 более термолабильный, чем брадизоитный ENO1.
192 БИОХИМИЯ И ОБМЕН токсоплазма
Ферментативные свойства двух enolases стадии конкретных, кажется, в хорошем согласии с метаболической и физиологической адаптации, необходимой в процессе Т. гондий дифференциации и encys-тации. Это может быть предположено, что эти ферменты играют дискретные биологические функции, которые, скорее всего, включают глубокую углеводный обмен Modi-такие как-модификацию биосинтез или деградацию амилопектина, которое происходит во время преобразования стадии Т. гондия.