Rhoptry разряд происходит на ранней стадии процесса Inva-Sion. Электронно-микроскопические наблюдения показывают пустые rhoptries еще в начальном апикальном контакте, создающий МДж. Сигналы и мехи-ханизмы секреции rhoptry содержания все еще совершенно неизвестны. Важность этого секре-ции в цитозоль и / или мембраны хозяина-клеток во время вторжения был недавно документированы (Mital и др., 2005). Действительно, скорость проходки белка разряда уменьшается в отсутствие AMA1, и эти паразиты не вторжению. Эти результаты указывают на то, что интимное прикрепление паразита в клетку-хозяина является необходимым условием для эффективного rhoptry лампы секре-ции. Будь RON и ROP белка разряда являются одновременное или последовательное не известно, хотя некоторые данные свидетельствуют о синхронности (Лебрен и др., 2005). Со-иммуноокрашивание ССДА и РОНС показывает, что МИК является экзоцитозом, прежде чем РОНС (Лебрено и др., 2005). Как ROPs введены в клетке, неизвестно. Подробная информация о структуре rhoptry во время вторжения красных клеток пути Plasmodium показывает куполообразную структуру красно-клеточной мембраны, который входит в наконечник rhoptry канала, который трудно интерпретировать (Bannister и Mitchell, 1989). После того, как секретируется, rhop попробуйте белки ассоциируют с различными отсеками и, скорее всего, выполняют широкий спектр функций:
● РОНС остаются связанными с MJ
● некоторые ROPs ассоциировать с PVM, и
● другой ROPs находится в ядре hostcell (Коллер и др, 2005;. Gilbert и др., 2006).
11.5.3.1 Перемещение ответвительные-ассоциированные белки
Белок RON4 секретируется во время вторжения и отлично следит за ходом вторжения, строго связан с MJ, с не распространяется на область задней части паразита, как отмечено
|
|
для МИК (Alexander и др, 2005;.. Лебрен и др, 2005). Последовательность RON4 не показывает домен TRANSMEM-бранную, предполагая, что она должна быть секретируемых в пространстве между паразитом и хозяином мембраны, и, следовательно, может соединить молекулы с обеих сторон. Это подтверждается доступность RON4 с антителами в отсутствие permeabi-лизации (Александр и др, 2005;. Лебрен и др., 2005). Наличие Ron2 и RON5 на стыке не было продемонстрировано. Их доступность антител может быть ограничено путем введения трансмембранного. Если RON4 играет определенную роль в преодолении паразита и хозяина-клеточных поверхностей, аналогами такого соединительного белка на стороне хост-клеток и стороны паразита, также должны быть идентифицированы.
Microneme белок AMA1, который секретируется во время вторжения и relocalizes на поверхности паразита, ассоциируется с комплексом RON. AMA1 поэтому, вероятно, якорь комплекс RON на поверхности паразита (Александр и др., 2005). Ron2 также может быть вставлен в поверхность паразита и играть подобную роль. На стороне хост-клеток, либо RON4 или другой член комплекса может связывать молекулы клеточной поверхности, на которой будет оказываемого сила метательным паразита внутри вакуоли. Эта молекула может быть трансмембранный белок хост-клетка или, альтерна-тивно, белок паразит (возможно, членом комплекса), вставленную в мембрану клетки-хозяина (Лебрен и др., 2005). В последнем случае, паразит будет генерировать все распределительные машины, так же как некоторые бактерии, такие как E.coli, энтеропатического (ЕРЕС),
|
|
Привлекательная является гипотезой, что AMA1, который представляет собой тип 1 трансмембранного обмен белков homolo-ЭДД с MIC2 в его CD, может взаимодействовать с glideosome для обеспечения транслокации МДжа во время вторжения. Однако AMA1 не обладает в своем С-конце критического триптофан видели в TRAP, TRAP-C1, MIC2, MIC6, MIC8 и MIC12, что необходимо для взаимодействия с submembra-сметка цитоскелет техника (Jewett и Сибли, 2003). Его С-домен 20 аминокислот длиннее, чем большинство семей TRAP С-доменов, и это не является обязательным для любой формы скользя моторику (МИТАЛ и др., 2005). Поэтому косвенное взаимодействие кажется
298 Toxoplasma Секреторные БЕЛКИ И ИХ РОЛИ В инвазии клеток и внутриклеточное ВЫЖИВАНИЕ
более вероятно, возможно, за счетом взаимодействия между AMA1 / RON комплексом и другим ССДОМ ТМА, занимающим MJ областью.
В MJ, хост-клеточные белки отделены в зависимости от их закрепления в мембране, что приводит к исключению трансмембранных белков, но не GPI-заякоренных белков из формующей паразитофорной вакуоли (Mordue и др., 1999b). Является ли участие РОНС в Selec-онно сегрегации до сих пор неизвестна. Кроме того, способствует ли узловой комплекс закрытие PV и слияние остается исследовать.
11.5.3.2 PVM-ассоциированный УОП
Rhoptry-производные везикулы секретируемых в хост-клеточной цитоплазме. Эти везикулы содержат липидную Compo-ненты, полученные предположительно от rhoptry липидов; и некоторые rhoptry белки, такие как ROP1, и белки семейства ROP2 (по крайней мере ROP2, ROP4, ROP5 и ROP7) (Саффер и соавт, 1992;. Бекерс и др, 1994;. Кэри и др, 2004b;. El Хадж и др., 2005, 2006с). Они, вероятно, содержат другие rhoptry Компо-нентов, а также. Эти пузырьки сливаются с зарождающейся PVM и ROPS белки становятся подвержены стороне хост-клеток (Хоканссон и др., 2001) (Бекерс и соавт, 1994;. Кэри и др, 2004b.).
|
|
Роль PVM-ассоциированный РОП не ясно. В любом внутриклеточным паразитом, окруженный вакуоли мембраны, мембрана служит в качестве важного функционального интерфейса между паразитом и цитоплазме хозяина-клеток. Для Т. гондия, импорт питательных веществ происходит через PVM; принимающие митохондрии и эндоплазматический ретикулум набирают и физически привязаны к PVM (Синайский и др., 1997). Микротрубочки хоста-клетки (Мел и др., 2001;. Романен и др, 2005) и промежуточная сеть нитей реорганизованы вокруг PVM (Халонно и Вайднер, 1994), а также внутриклеточный паразит способны ингибируют-ную Host- апоптоз клеток внутри PVM. Transmembrane rhoptry белки ПВМ хорошо расположен, чтобы играть важную роль (ы) в функции PVM.
Структура участвует в питательном приобретении (Schwab и соавт., 1994).
ROP2 было показано, что один из медиаторов ПВМ-органеллы ассоциации, которые могут обеспечить передачу липидов в манере, аналогичной трафик липидов на участках непрерывности мембраны между митохондриями и ER (Синайским и др, 1997;. Синай и Столяр, 2001). N-концевой домен ROP2, который содержит характерную митохондриальную ориентации сигнала, подвергается хост-цитозолу клетки и позволяет набор митохондрий и эндоплазматического ретикулума к PVM (Синайский и др, 1997;. Синай и Столяр, 2001), Вставка в chondria-митохондрий включала 30 Н-концевую аа, а неустановленный ER-таргетинг сигнал также присутствует в ROP2 (Синай и Столяри, 2001). Механизм митохондриальной мембраны вставки пептида четко не известно, но, кажется, происходит от нетрадиционным импорта пути.
ROP2 описываются как PVM-интегрально-TRANSMEM брана белок, с С-концевым хвостом открытым в вакуоли пространстве (Бекерс и др., 1994). Же топология наблюдалась для ROP4 (Эля-Хаджа и Dubremetz, неопубликованный), но ROP5 будет найден вставлен в PVM, подвергая его С-концевой хвост к хост цитозолу, в обратной топологии по сравнению с ROP2 и ROP4 (Эль Хаджа и др и др., 2006c). Как и почему эти родственные белки принимают перевернутый topolo-ЭДД остается невыясненными. Кроме того, предполагаемый трансмембранный якорь из этих белков находится в пределах киназы-подобный домена в положении, которое, как правило, захоронено в пределах гидрофобной сердцевины белка (pfam00069.11) (El хадж и др., 2006c). Если развертывается этот домен, чтобы выставить этот PUTA-онно Анкерный элемент еще предстоит определить.
ROP4 недавно было показано, что phosphory-веден на нескольких остатков серина / треонина внутри зараженной клетки после секреции (Кэри и др., 2004b). Полученные результаты свидетельствуют о том, что ROP4 является мишенью для принимающих или паразита киназ, которые активируются в ответ на вторжение. Идентификация этой киназы (ов) будет важной областью для дальнейшего исследования.
ROP2 было показано, что важно. Действительно, целенаправленное истощение ROP2 с использованием рибозима-модифицированных результатов, на антисмысловой стратегии РНК в нарушение rhoptry биогенеза, нарушение цитокинеза, снижение в ассоциации клетке-хозяине
| ГРАНУЛЫПЛОТНЫХ |
митохондрии с PVM, уменьшается поглощение стерин из клетки-хозяина, снижается способность паразитов к вторжению и репликации в фибробластах человека, а также ослабление вирулентности у мышей (Nakaar и др., 2003). Важность ROP2 и тот факт, что паразит, по-видимому синтезировать одновременно несколько гомологов предположить, что они служат важные функции, но кажущаяся незаменимость ROP2 предполагает, что они не могут дополнять друг друга, и возникают вопросы об их индивидуальных ролей. ROP5 может также иметь важное значение, так как несколько попыток делеции гена ROP5 потерпели неудачу (Эль-Хадж и др., 2006c). ROP4, вероятно, выполняет избыточную роль, так как функциональный нокаут, полученный в недавнем экране ловушки белка GFP, предполагает, что это необязательное (Брэдлите и др., 2004).
11.5.3.3 ROPs таргетингом на хост-ядра
Клетки, инфицированные Т. гондий пройти вверх или вниз регуляцию подмножества генов и, в зависимости от вирулентности, различные штаммы Т. гондия показывают значительные различия в способности модулировать гены хозяина-клетки. Эти гены кодируют хемокинов (GRO1, GRO2, LiF и MCP1), цитокины (IL-1β, ИЛ-6), матричные клетки и белки адгезии (ICAM-1 и матриксной металлопротеиназы 3), апоптическая (супероксиддисмутаза 2) и регуляторные факторы транскрипции (отн-Б, NF-κВ р105, I-κВα) (Blader и др., 2001). Многие из этих генов МОДУЛЫ-ций зависят от прямого взаимодействия с тахизоитами, и не вызваны растворимыми секретируемыми продуктами. Эти результаты показывают, что молекулы пара-сайт может влиять на хост-машин клеток, но белки Т. гондий, участвующие в такой регуляции экспрессии генов хозяина неизвестны.
Два последних сообщения свидетельствуют о том, что rhoptry белки могут участвовать в этой принимающей модуляции. Действительно, rhoptry TgPP2C ориентирована на хозяина ядра рано после заражения, предполагая, что он может непосредственно взаимодействовать с молекулами хозяина-клеток и управления хост-клеточного цикла (Gilbert и соавт., 2005). Аналогичным образом, rhoptry белок ROP16 местные-izes к хост-ядра (Коллер и др., 2005). В соответствии с его ядерным местом, ROP16 содержит сигнал ядерного импорта. Кроме того, он обладает киназным доменом вероятно фосфорилировать
Молекулы хост-клеток, а затем вмешиваются с функциями хост-клеток. Интересно, что ген ROP16 принадлежит к локусу, содержащей несколько генов, участвующих в манипуляции экспрессии генов хост-клеток (Коллер и др., 2005).
ПЛОТНАЯ ГРАНУЛА
11.6.1 Плотные-гранулы белков:
ГРА и другие
Характеристика плотных зернистых молекул начал с производства моноклональных Antibod-х годов против ин витро экскретируемых-секретируемых антигенов (ESA) и субклеточном фракционирования тахизоитов (Cesbron-Delauw и др., 1989, Шариф и др, 1990;. Leriche и Dubremetz, 1991). Список плотных-гранул белков, которые были идентифицированы и охарактеризованы неуклонно растет на протяжении последних 15 лет с тех пор Cesbron-Delauw и его коллеги, впервые описанных Р23 (Cesbron-Delauw и др., 1989), который впоследствии был переименован GRA1 согласно номенклатуре предложенный Сибли и др. (1991) (см таблицу 11.3). Плотные-гранулированные белки представляют собой группу сравнительно небольших белков, все представляя собой N-концевую гидрофобную последовательность, которая соответствует характеристикам сигнального пептида (для обзора см Мерсья и др., 2005). для некоторых случаев, когда конкретная ферментативная или регулирующая функция определена (см ниже) За исключение случаев, большинство из плотных гранул-белков не представляет какое-либо значительное сходства ни друг с другом или с белками с известной функцией. Они были названы GRA белки исключительно на основе их внутриклеточной локализации в плотных гранулах стадии тахизоит (Сиб и др., 1991). До сих пор, девять белки дано обозначение GRA были охарактеризованы (Мерсье и др., 2005).
GRA1 представляет собой распространенный белок - примерно 2 процента от общего числа ЭЧТ, полученных из кДНКа-библиотеки штамма RH (Ajioka и др., 1998) - то есть растворимая и характеризуются два предсказывали EF-Hand доменов (аа 149-180 и 197-223, соответственно), чей связывающий кальций свойство было подтверждено Experi-ментально (Cesbron-Delauw и др., 1989). За исключением GRA1, все белки ГРА описанные до сих пор
Таблица 11.3 Свойства Toxoplasma секреторные белки - плотные гранулы белки
| Место нахождения/ | вычисленный | Домены | взаимодействующий | мутант | Постсекреторный | ||
| белок | МВт (кД)1 | (Нет).2 | партнеры | фенотипы | функция | торговля | Рекомендации |
| Плотная гранула | |||||||
| GRA1 | EF-Hand (2) | кальций | Просвет | Cesbron- | |||
| переплет | ФЭ или | Delauw | |||||
| свободно | и другие., 1989; | ||||||
| связанный | Шариф и др., | ||||||
| с MNN | 1990; | ||||||
| Dubremetz | |||||||
| и другие., 1993 | |||||||
| GRA2 | амфипатические | GRA4, | Несущественный | МНН | ассоциированный | Шариф и др., | |
| α-спираль (2) | GRA6 | белок; KO | архитектура | с MNN | 1990; | ||
| мутантные показывает | Dubremetz | ||||||
| полный | и другие., 1993; | ||||||
| нарушение | Mercier | ||||||
| трубчатого | и другие., 1998a, | ||||||
| архитектура | 1998b, 2002; | ||||||
| из MNN; | Labruyere | ||||||
| менее вирулентными | и другие., 1999 | ||||||
| у мышей | |||||||
| GRA3 | ТМ (1) | ассоциированный | Achbarou | ||||
| с | и другие., | ||||||
| МНН и | 1991b; | ||||||
| PVM | Dubremetz | ||||||
| и другие., 1993; | |||||||
| Энрикес | |||||||
| и другие., 1991 | |||||||
| GRA4 | ТМ (1), АТФ / ГТФ | GRA2, | ассоциированный | Mevelec и др., | |||
| переплет | GRA6 | с | 1992; | ||||
| Несколько доменов (1) | МНН | Labruyere | |||||
| и другие., 1999 | |||||||
| GRA5 | ТМ (1) | KO-мутанты | ассоциированный | Lecordier | |||
| отображение нет | с | и другие., 1993, | |||||
| очевидный | PVM | 1999; | |||||
| фенотип | Mercier | ||||||
| и другие., 2001 | |||||||
| GRA6 | ТМ (1) | GRA2, | KO мутант | МНН | ассоциированный | Lecordier и др., | |
| GRA4 | результаты в | архитектура | с | 1995; | |||
| везикуляция | МНН | Labruyere | |||||
| от MNN; | и другие., 1999, |
| 300 Toxoplasma Секреторные БЕЛКИ И ИХ РОЛИ В инвазии клеток и внутриклеточное ВЫЖИВАНИЕ |
| менее вирулентными в | Mercier | ||||
| мышей | и другие., | ||||
| неопубликованный | |||||
| GRA7 | ТМ (1), РГД (1) | ассоциированный | Bonhomme | ||
| с | и другие., 1998; | ||||
| МНН и | Фишер и др., | ||||
| PVM | 1998; | ||||
| Jacobs и др., | |||||
| GRA8 | ТМ (1) | ассоциированный | Кэри и др., | ||
| с | |||||
| PVM | |||||
| GRA9 | амфипатические | ассоциированный | Adjogble и др., | ||
| α-спираль (1) | с MNN | ||||
| NTPase I | целевое | нуклеотидная | Просвет | Bermudes | |
| сокращение | triphos- | ФЭ или | и другие., 1994; | ||
| антисмысловыми | phatase, | свободно | Сибли и др., | ||
| РНК ингибирует | выход | связанный | 1994; | ||
| паразит | с MNN | Асаи и др., | |||
| пролиферация | |||||
| NTPase II | нуклеотидная | Просвет | Асаи и др., | ||
| triphos- | ФЭ или | ||||
| phatase, | свободно | ||||
| выход | связанный | ||||
| с MNN | |||||
| PI-1 | Kazal (4) | серин | Просвет | Pszenny и др., | |
| протеазы | ФЭ | 2000, 2002; | |||
| ингибитор | Моррис и др., | ||||
| ПИ-2 | Kazal (4) | серин | Просвет | Моррис и | |
| протеазы | ФЭ | Каррузерс, | |||
| ингибитор | |||||
| Cyp18 | циклофилин | протеин складные | Высокое и др., | ||
| 1994; | |||||
| Кэри и др., | |||||
| ГРАНУЛЫПЛОТНЫХ |
1На основе полной открытой рамки считывания в том числе сигнальной последовательности или сигнала якоря GPI, если таковой присутствует.
2Сокращения: ТМ, трансмембранный.
302 Toxoplasma Секреторные БЕЛКИ И ИХ РОЛИ В инвазии клеток и внутриклеточное ВЫЖИВАНИЕ
предсказаны, чтобы кодировать мембранные-ассоциированные домены на вторичном анализе структуры. Они представляют собой либо домен одного трансмембранный (GRA3, GRA4, GRA5, GRA6, GRA7 и GRA8) или Amphi-патическийα-helices (GRA2 и GRA9). Действительно, все эти белки были обнаружены GRA, связанные с мембранными системами PV (т.е. MNN или ПВМ).
Другая общая черта ГРА белков разница наблюдались между их теоретической молекулярной массой, рассчитанной из аминокислотной последовательности, и молекулярной массой нативного белка, поскольку обнаружено на SDS-PAGE лизатов из тахизоят. Это говорит о потенциальных пост-трансляционные модификации (для обзора см Мерсье и др., 2005). Несмотря на многочисленные N- и О-гликозилирования предсказаны в пределах ГРА аминокислотных последовательностей, лишь несколько ГРА белки было показано, что О-гликозилированным:. GRA2 (. Zinecker и др, 1998), GRA4, (Achbarou и др 1991b), и GRA6, (Travier и др., неопубликованные данные). Относительная насыщенность ГРА белков в заряженных аминокислотах и остатках пролина может также учитывать различия между теоретическими и молекулярными весами. Су-18, присутствуют в ГД, а также в пределах PV (высокий и др., 1994),
Вторая группа включает в себя несколько растворимых плотных гранул белков с известной функцией, как циклофилинов (Кэри и др., 2000), нуклеотидные triphosphatases (NTPases) (Бермудес и др, 1994;.. Асаи и др, 1995), и ингибиторы серин-протеазы семьи Kazal (TgPIs) (Pszenny и др, 2000, 2002; Morris. и др., 2002; Morris и Каррузерс, 2003). Два NTPase изоформы, TgNTPase-я и TgNTPase-II (ЕС 3.6.1.3), немного отличаются на генетическом уровне (97 процентов идентичности), были описаны в Toxoplasma тахизоитов, и один в Neospora сатпит (Асаи и др., 1998), Ген, кодирующий TgNTPase-II, содержится во всех штаммов T. гондий, в то время как ген, кодирующий TgNTPase-я ограничен вирулентных штаммов (Бермудес и др, 1994;. Асаи и др., 1995). В пробирке активности этих ферментов были широко охарактеризованы,