Понимания механизмов современной терапии

ВВЕДЕНИЕ

Как паразитические простейшие, то Apicomplexa Encom-передать широкий спектр патогенных видов, для которых в настоящее время метода лечения являются либо недостаточными или угроза-подавляется возникающей лекарственной устойчивостью. В этой главе рассматривается производительное применение токсоплазмов в качестве модельной системы для apicomplexan наркотиков Discov-Эри, в частности, для проверки потенциальных мишеней. Потребность в эффективных инструментов проверки частично обусловлено множеством потенциальных целей выявленной систематического сравнительного анализа завершенных геномов токсоплазмы, Theileria, Plasmodium, Cryptosporidium и Егтепа (Нене и др., 2000; Gardner и др, 2002, 2005.; Abrahamsen и др., 2004;. Баль и др, 2002). Однако, новизна одна гена или пути в

геном возбудителя по сравнению с хозяином не является единственным критерием для признания потенциальной цели привлекательных один. В самом деле, некоторые хорошо установленные или новые противопаразитарные целями являются ортологами ферментов, присутствующие в животном хозяине, где тонкая эволюционная дивергенция может быть эффективно эксплуатируемого селективных низкомолекулярных ингибиторами. Принципиальное значение для любого открытия начинания является генетической проверкой, демонстрация того, что потенциальный ген-мишень имеет важное значение, а не функционально избыточной или (неожиданно) несущественный характер. В Commer-CIAL программ, где значительные инвестиции медицинской химии, как правило, требуется, чтобы разработать подходящие фармакокинетические свойства и безопасности от первоначальных выводов, строгой генетической, а также фармакологической проверки мишени

Токсоплазма. Модельные Apicomplexan-перспективы и методы, под редакцией Weiss & Kim

ISBN-13: 978-0-12-369542-0

ISBN-10: 0-12-369542-2

Copyright © 2007 Elsevier Ltd.

Все права воспроизведения в любой форме зарезервированы.

506 Toxoplasma В качестве модельной системы ДЛЯ APICOMPLEXAN открытия новых лекарств

является необходимым условием. В качестве наиболее хорошо развитой apicomplexan системы для молекулярно-генетического Manip-авляет, токсоплазмы идеально подходят для этой цели. С полным комплектом молекулярных инструментов, доступных, молекулярно-генетический опрос любого интересующего гена теперь в высшей степени возможно. Легкость, с которой токсоплазмы можно выращивать как в пробирке и в моделях грызунов облегчает оценку соединений с желаемой эффективностью и фармако-логических свойствами. Аменабельность как токсоплазмы и его мышиного хозяина к генетической manipu-ушной может помочь определить селективность соединения процессов в паразита по сравнению с analo-Гусь те, у хозяина, а также оценить некоторые-кратная синергетическое взаимодействие между антипаразитарной эффективностью и иммунная система хозяина.

Использование токсоплазмов в качестве модели паразита для исследования различных аспектов apicomplexan биологии была предметом предыдущих обзоров, в которых полезность, а также ограничение этого податливым суррогата была четко прописанными (Русо и др, 1999a, 1999b;. Ким и Weiss, 2004). Там, где четкие ортологи целевых ферментов или белков присутствуют через родственные виды, мольки-улар генетическая проверки подходов в Toxoplasma часто продуктивны. Например, резиста-ANCE детерминанты нескольких широкого спектра клинически используемых препаратов, в том числе пириметамин-сера и атовакуона, были подтверждены на уровне целевых ферментов путем мутационного анализа в Toxoplasma (McFadden и др., 2001). С другой стороны, Токсоплазмы и малярия отличаются настолько глубоко в ключевых аспектах их жизненного цикл, что основной механизм оплот противомалярийных (например, аминохинолины или artemisenins) не может быть изучены в этой системе, из-за отсутствие пищи вакуоль эритроцитарных стадий. Для близкородственных кокцидий, такие как Eimeria, Sarcocystis и Neospora, Toxoplasma, вероятно, будет более последовательно полезной моделью, поскольку они все разделяют Сей-лар жизненного цикл спорозоитов вторжения, sporogeny, merogeny и развитие ооциста в кишечнике эпителии их окончательные хосты. Для evolu-tionary далекого apicomplexans Cryptosporidium и Theileria, однако, где существует гораздо большая степень метаболических и физиологической дивергенция (Нен и др., 2000; Huang и др., 2004; Striepen и Kissinger, 2004; Striepen, 2006), там Sarcocystis и Neospora, Toxoplasma, вероятно, будет более последовательно полезной модели, поскольку они все разделяют в Сими-лар жизненного цикла спорозоитов вторжения, sporogeny, merogeny и развитие ооцист в эпителии кишок их окончательных хозяев. Для evolu-tionary далекого apicomplexans Cryptosporidium и Theileria, однако, где существует гораздо большая степень метаболических и физиологической дивергенция (Нен и др., 2000; Huang и др., 2004; Striepen и Kissinger, 2004; Striepen, 2006), там Sarcocystis и Neospora, Toxoplasma, вероятно, будет более последовательно полезной модели, поскольку они все разделяют в Сими-лар жизненного цикла спорозоитов вторжения, sporogeny, merogeny и развитие ооцист в эпителии кишок их окончательных хозяев. Для evolu-tionary далекого apicomplexans Cryptosporidium и Theileria, однако, где существует гораздо большая степень метаболических и физиологической дивергенция (Нен и др., 2000; Huang и др., 2004; Striepen и Kissinger, 2004; Striepen, 2006), там

мало оснований для полезного сравнения с токсоплазмозом. В случае Cryptosporidium, сравнительный анализ Toxoplasma и малярии геномов показывает, что такие различия являются следствием большой доли горизонтального переноса генов (от бактерий и водорослей эндосимбионтов), геном миниатюризации, а также потерь пластиды и mitochon-drial функции (Абрахамсен. и др, 2004; Huang и др, 2004)..

Глава начинается с краткой историей использования Toxoplasma для рассечения apicomplexan путей меты-Болича, которые потенциально годные для использования в качестве химиотерапевтических целей. Чтобы свести к минимуму дублирование с предыдущим обзорам (Макфадден и Руса, 1999; McFadden и др., 2001; Coombs и Muller, 2002; Seeber, 2003; Campbell и соавт., 2004; Ким и Weiss, 2004;. Lu и др, 2005), основные моменты последней работы будут подчеркнуты или темы баловались, где личный опыт может обеспечить перспективу. Обсуждение текущих стратегий для промышленных антимикробных программ обнаружения наркотиков будут следовать, которые благоприятствуют использование клеточных анализов для трафаретных ИНГ составных коллекций, а не анализов ферментов-мишеней на основе. Побочный продукт этого недостатка априорного внимания то, что это может привести к обнаружению новых целей и биологических процессов, которые не могли бы быть в противном случае предсказанного обоснования или в Silico конструкции. Обнаружение широкого спектра антикокцидийного соединения, которое блокирует паразит вторжения хозяина-клетки посредством селективного ингибирования цГМФа-зависимой протеинкиназы (PKG) обеспечивает превосходный пример полезности такого подхода. Он также предлагает возможность представить социологическое исследование о том, как модельная система Toxoplasma обеспечила поддержку и стимул для усилий лекарственной химии сосредоточен на этой цели в патогена Eimeria (Donald и др., 2002; Gurnett и др., 2002; Biftu и др., 2005, 2006). Использование сконструированного PKG alleleic вариантов невосприимчивой к ингибиторам в анализах фермента, а также в трансгенных паразитах служит средство для измерения селективности соединений во время свинцового процесса оптимизации, а также способа идентификации потенциальных целей киназы вторичного белка, который также может внести свой вклад в эффективность соединения. В последнем разделе, будущие перспективы для токсоплазмов в качестве инструмента проверки обсуждаются в контексте последних техно-логические событий, такие как системы для генетического

комплементации и строительство штаммов ген нокаутных-ционным ули. Глава завершается прагматической перспективой на будущее открытие apicomplexan наркотиков.

понимания механизмов современной терапии

Антифолат терапия

Синергетические комбинации антагонистов фолиевой кислоты и серосодержащие препараты были использованы для лечения различных бактериальных и патогенных микроорганизмов, apicomplexan входит-ную Toxoplasma и Plasmodium видов. Режим пириметамин-серосодержащие остается наиболее эффективным средством для лечения симптоматической toxoplasmo-лиза, и до появления широкого распространения лекарственной устойчивости также фронтовой для лечения малярии. Пириметамин является конкурентным ингибитором паразита DHFR с узким (~ шестикратное) selectiv-итй для гондий фермента Т. по сравнению с ферментом млекопитающих (Швейцер и др, 1990; и. Chio Queener, 1993). Это небольшое терапевтическое окно может объяснить некоторые из токсичности, связанной с лекарственным средством, которое является обратимым путем совместного введения фолиновой кислоты. Одна из основных проблем комбинированной терапии антифолата является в целом плохо Толер-ANCE пациентов для компонента серосодержащих наркотиков (сульфадоксин или сульфадиазин), что исключает их профилактические или длительное использование. Когда возникает гиперчувствительность серосодержащего препарата у пациентов, токсоплазмоза, клиндамицин, азитромицин или atovoquone могут быть замещены. Ни один из этих препаратов не очень эффективен в качестве монотерапии, но в сочетании, наблюдается синергизм с пириметамин (Djurkovic Djakovic и соавт, 1999, 2002;.. Chirgwin и др, 2002). Атоваквон также используется в сочетании с антифолатом прогванил (пролекарство cycloguanil) для лечения хлорохинов устойчивости малярии (Malorone). Взаимодействие всех этих препаратов с их целевыми ферментами настоящее время установлено, в большинстве случаев значительно Aided за счет использования токсоплазмы в качестве экспериментальной системы.

Клонирование, экспрессия, и последующее био-химический анализ плавленого DHFR-TS фермента Toxoplasma (Donald и Roos, 1993; Roos, 1993;

Трухильо и др., 1996) привела к детальному пониманию наркотиков целевых взаимодействий и механизмов лекарственной устойчивости, которые также служили в качестве полезной модели для малярийного фермента. Активный рекомбинантный бифункциональный Т. гондий DHFR-TS более легко выражены в E.coli и в трансгенных паразитов, чем его тесно связаны малярийной контр-части, что облегчает моделирование аллельных вариантов, связанных с малярийной полевых изолятов устойчивы к пириметамин-серосодержащие терапии (Рейнольдс и Roos, 1998). В этом исследовании, токсоплазмы DHFR-TS замен (и их комбинации) analo-Гусь, чтобы те, которые связаны с пириметамин и cycloguanil сопротивления малярии DHFR-TS остатков позволило реконструкции вероятного филогении мутаций устойчивости, которые появляются, происходит ступенчато в малярия. Эти прогнозы можно рационализировать на уровне их влияния на кинетику фермента и архитектуры связывающего сайта, с использованием модели сходства на основе кристаллической структуры Leishmania крупного DHFR-TS. Комбинации Arg59+ Asn108 и Arg59 +Ser223 (нумерация П. фальципарум) является особенно устойчивым к пириметамин, что приводит к снижению 80-кратного в восприимчивости к пириметамин для паразитов, несущих одну копии TgDHFR-TS транса-гены по сравнению с нетрансформированными паразитами. Фитнес расходы, связанные с этими наркотиками сопротивляются-Анс аллелью были оценены в последующей деятельности в пробирке и исследовании конкуренции между естественной изогенным в

T. гондий тахизоиты укрывательство дикого типа и

мутантные DHFR-TS аллели (Fohl и Руса, 2003). Сочетание Arg59+ Asn108 не оказывает никакого влияния на пригодность в культивируемых паразитов, в то время как Arg59 +

Ser223 пара придала значительный фитнес дефект >2,8 процента в поколение. У инфицированных мышей, бывший alleleic Комбинацию outcompeted

на дикого типа быстрее, чем это было последним. Результаты помогают объяснить, почему Arg59+ Asn108

сохраняется в полевых изолятов P. малярийного, в то время как Arg59 + Ser223 комбинация наблюдалась только в лабораторных штаммов.

Моделирование малярийного пириметамина резист-ANCE аллели и их применение в качестве селективных маркеров в Toxoplasma (Donald и Roos, 1993) непосредственно привела к разработке первого поколения векторов для стабильной трансформации малярии (Дональд и Roos, 1993; ван Дейк и др., 1995; Крэбб и

508 Toxoplasma В качестве модельной системы ДЛЯ APICOMPLEXAN открытия новых лекарств

Скотопромышленник, 1996; В и др., 1996; Крэбб и др., 1997; Ван-дер-Wel и др., 1997). Впоследствии, ориентированные конструкции с использованием миниген TgDHFR-TS (или аналогичное П. berghei конструкции), были использованы для создания различных генов и генных замен нокаутов в P. фальципарум, P. berghei, и П. knowlesi для функциональных исследований (султан и др аль, 1997;. Триглия и др., 2000; Томас и др., 2001;. Billker и др, 2004). Таким образом, ранняя работа в токсоплазмы, который был вдохновлен вызов, чтобы понять лекарственную устойчивость малярии в конечном счете, внесли значительный вклад в развитие инструментов молекулярной генетики для обеих систем.

Клиническое сопротивление пириметамин-серосодержащие þér-APY в токсоплазмах не было проблемой, что это было в малярии по нескольким причинам. Во-первых, в отличие от малярии, устойчивость клинического препарата в токсоплазмы не может быть легко передается, если она возникает в ответ на лечение. Во-вторых, в большинстве случаев Т. гондий инфекции являются самоограничивающим и бессимптомно, как в окончательного хозяина (кошачьих) и вторичных (хостов других животных). В результате, первичный Reser-ВОИР потенциальной инфекции никогда не подвергаются медикаментозной терапии. Были предприняты усилия для скрининга Toxoplasma клинических изолятов с помощью ПЦР-амплификации на наличие мутаций в DHFR-TS и генов, которые могут DHPS придающих устойчивость к пириметамин-сульфадоксин терапии (Аспинолл и др., 2002a, 2002b). DHPS является мишенью серосодержащих препаратов, и множественное сопротивление MUTA-ции, связанные с неудачной комбинированной терапией были идентифицированы в малярийном ферменте (Dorsey и др., 2004; Ogutu. и др, 2005; Омар и др., 2005). Нет мутации, которые могли бы быть окончательно связаны с воздействием комбинированной терапии не были найдены в Toxoplasma, хотя один из четырех полей-морфизмов, идентифицированных в гене DHPS-соот вовал аллель, связанный с устойчивостью к сульфонамиду в малярии. Это повышает вероятность того, что в природе, лекарственная устойчивость, придающие полиморфизмы DHPS присутствуют в популяции паразита при отсутствии давления наркотиков. хотя один из четырех полей-морфизмов, идентифицированных в гене DHPS-соот вовал аллель, связанный с устойчивостью к сульфонамиду в малярии. Это повышает вероятность того, что в природе, лекарственная устойчивость, придающие полиморфизмы DHPS присутствуют в популяции паразита при отсутствии давления наркотиков. хотя один из четырех полей-морфизмов, идентифицированных в гене DHPS-соот вовал аллель, связанный с устойчивостью к сульфонамиду в малярии. Это повышает вероятность того, что в природе, лекарственная устойчивость, придающие полиморфизмы DHPS присутствуют в популяции паразита при отсутствии давления наркотиков.