Полезная иллюстрация того, как модель система токсоплазмы обеспечила эффективную поддержку для обнаружения анти-кокцидиального наркотиков является цГМФа-зависимой программой ингибитора протеинкиназы Мерки. Эмпирическое скрининга удар был первоначально идентифицирован, что показало перспективный широкий спектр действия в пробирке Activ-ности против различных паразитов кокцидий, в том числе Б. jellisoni, Е. tenella, Т. гондия и N.caninum,
| Toxoplasma В качестве модельной системы ДЛЯ APICOMPLEXAN открытия новых лекарств | |||||||||||
| N | N | Нью-Гемпшир2 | |||||||||
| N | N | ||||||||||
| ЧАС | N | ||||||||||
| N | N | ||||||||||
| N | О | N | N | ||||||||
| N | |||||||||||
| F | S | F | ЧАС | ||||||||
| F | |||||||||||
| SB203580 | Соединение 1 | Соединение 2 | |||||||||
| Нью-Гемпшир2 | О | ||||||||||
| N | ОЙ | ||||||||||
| ЧАС | HN | CI | HN | CI- | |||||||
| N | N | N | |||||||||
| N | N | ||||||||||
| F | N | HO | N | HO | N | N | N | ||||
| N | N | ||||||||||
| ОЙ | |||||||||||
| ЧАС | ЧАС | ||||||||||
| SB202190 | Aminopurvalanol | Purvalanol B |
РИСУНОК 19,2 Эталонные соединения: SB203580 и SB202190, ингибиторы р38 МАР-киназы; соединение 1 и соединение 2, ингибиторы паразита PKG; aminopurvalanol А и purvalanol В, ингибиторы CDK млекопитающих и паразита CK1.
(Gurnett и др., 2002;. Wiersma и др, 2004). Ведущий,
a 2,3-diarylpyrrole упоминается как соединение 1 (рис 19.2), был активен против нескольких ключевых пато-генных видов Eimeria в цыпленке и против T.gondii, в мышиной модели (Нарэ и др., 2002; Biftu и др., 2005). Соединение также имеет в пробирке и в естественных условиях активности против С. neurona (Поулз, Lindsay и Освободителя, в процессе подготовки). Это по-видимому, избирательно токсичен для кокцидий паразитов, показывая слабую активность против клеток млекопитающих в культуре клеток
(в < 10 ìМ) или токсичность для кур или мышей (в
< 50 мг / кг дозы). Лиганд анализ связывания с triti-ованные соединения 1 используется для отслеживания один пик активности связывания в Eimeria ооцист лизатов через несколько хроматографических колонок стадий очистки (Gurnett и др., 2002). Аминокислотный секвенирование белка высоко обогащенного 120-кДа с последующим вырожденного ПЦР-клонированием привело к однозначной идентификации паразита ортолога позвоночных цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG). В отличии от животного фермента, очищенный Eimeria PKG является весьма кооперативным по отношению к активации цГМФа и чувствительным к югу нМу уровням соединения 1. Как и большинство ингибиторов протеинкиназы, ингибирование
соединение 1 является АТФ-конкурентным и неконкурентным по отношению к пептидному субстрату.
Toxoplasma была очень эффективной системой для экспрессии активного рекомбинантного фермента PKG для функциональных исследований. Первоначальные попытки получить активный фермент в различных гетерологичных системах, в том числе E.coli, дрожжей и bacculovirus, не удалось произвести фермент с свойствами resem-шику тех из нативного фермента. Например, несмотря на адекватный уровень растворимого рекомбинантного фермента выделяли с использованием системы бакуловируса, он показал плохую удельную активность и жутко-оперативная кинетика цГМФ-активации. В противоположность этому, очистка FLAG эпитопом-меченый рекомбинантный Eimeria tenella PKG (EtPKG) из трансгенных паразитов Toxoplasma получали фермент, который был неотличим в кинетических свойств из очищенного нативного фермента (Donald и Освободителя, 2002; Gurnett и др., 2002). Т. аналогичным образом выражается гондии PKG фермента (TgPKG) в активной форме из трансгенных паразитов (Donald и др., 2002). Этот технический подвиг способствовал детальный молекулярный анализ кокцидий PKG фермента, объясняя многие из его уникальных свойств. Новый третий
| ВАЛИДАЦИЯ цГМФа-зависимая протеинкиназа (PKG) - ПРИМЕР |
циклические ГМФА аллостерического сайт, отсутствуют в PKGs животных, как был показан, формирует основу для жестких цГМФа-регуляторных свойств фермента и цГМФа-связывающего сайт кооперативности (Salowe и др., 2002). Это третье место было также показано, что важное значение для ферментативной активности, что делает его потенциальной мишенью ингибитора в своем собственном праве. Мембрана объединение большей изоформы EtPKG и TgPKG было показано, что связанно с двойной N-концевой myristoyla-ции и пальмитоилированием полипептида, инициированным выше по потоку кодона метионина (Donald и Освободителю, 2002). Косвенные данные из двух различных стратегий генной ориентации дали убедительные доказательства того, что ген PKG имеет важное значение для тахи- zoite пролиферации, обеспечивая генетическую проверку его значения в качестве терапевтической мишени. Использование гена молниеносного таргетирования подхода (Donald и Roos, 1998), PKG локус pseudodiploids только решил дикий тип, но не PKG неопределенной Сегры-Ганц следующих counterselection для удаления векторных последовательностей. Во втором подходе, исчерпывающих генные таргетирования эксперименты с генной PKG нокаутированных векторов паразитов дикого типа не удалось создать PKG нулевые мутанты, которые препятствуют родной PKG Експрес-Sion. Тем не менее, такие мутанты могли быть легко извлечены из трансгенных линий, экспрессирующих Func-ционных рекомбинантный PKG в трансе. Трансгены Капа-BLE из дополняющих PKG нокаутных мутаций включают те, экспрессирующие ацилированные или не ацилированные формы EtPKG, демонстрируя, что фермент Eimeria полностью функционален и что PKG ацилирования самого по себе не является существенным в Toxoplasma тахизоитов. исчерпывающих генные таргетирования эксперименты с генной PKG нокаутированных векторов паразитов дикого типа не удалось создать PKG нулевые мутанты, которые препятствуют родной PKG Експрес-Sion. Тем не менее, такие мутанты могли быть легко извлечены из трансгенных линий, экспрессирующих Func-ционных рекомбинантный PKG в трансе. Трансгены Капа-BLE из дополняющих PKG нокаутных мутаций включают те, экспрессирующие ацилированные или не ацилированные формы EtPKG, демонстрируя, что фермент Eimeria полностью функционален и что PKG ацилирования самого по себе не является существенным в Toxoplasma тахизоитов. исчерпывающих генные таргетирования эксперименты с генной PKG нокаутированных векторов паразитов дикого типа не удалось создать PKG нулевые мутанты, которые препятствуют родной PKG Експрес-Sion. Тем не менее, такие мутанты могли быть легко извлечены из трансгенных линий, экспрессирующих Func-ционных рекомбинантный PKG в трансе. Трансгены Капа-BLE из дополняющих PKG нокаутных мутаций включают те, экспрессирующие ацилированные или не ацилированные формы EtPKG, демонстрируя, что фермент Eimeria полностью функционален и что PKG ацилирования самого по себе не является существенным в Toxoplasma тахизоитов.
Как описано в предыдущих примерах, меха-низм, с помощью которого лекарственное средство взаимодействует избирательно с его мишенью часто обнаруживается через понимание детерминант резистентности. Наличие аллелей, способных придавать устойчивость к соединению 1 первоначально было предсказано из подобия модели 2,3-diarylpyrrole-ферментного комплекса на основе кристаллической структуры млекопитающих р38 МАР-киназы (альфа-изоформы). Траектория фермента позвоночника PKG, наложенного на структуру киназы р38 предсказывает, что эти два фермента отображения соответствующей каталитической архитектуры сайта.
Р38 фермент является главной мишенью лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, так как ингибиторы блокируют proin-flammatory продукцию цитокинов в животных моделях
(Кумар и др., 2003). Соединение 1 сам по себе, первоначально создана как часть программы антагониста рецептора глюкагона, является известным ингибитором р38 МАР-киназы (СК5020 нМ) (де Ласло, 1999). С другой стороны, несколько коммерчески доступных ингибиторов р38 МАР-киназы также ингибируют PKG, в том числе трехкратно imida-zoles SB202190 (IC50 6 нМ) и SB203580 (ИС5010 нМ) (рис 19,2) (Дональд, неопубликованные результаты). Интересно, что эти ссылки соединения также показывают некоторую активность против Toxoplasma в пробирке (Wei и др., 2002), хотя на уровнях, которые в десять раз выше, чем наблюдаемые для ингибирования соединением 1. Предполагаемый токсоплазмы ортолог р38 МАР-киназы был клонированы и охарактеризованы, но по-видимому, относительно нечувствительны к этим ингибиторам (Brumlik и др., 2004) (SB203580 ИК50135 нМ). Таким образом, представляется более вероятным, что ограниченная противопаразитарное активность этих соединений опорного p38 связано с ингибированием паразита PKG.
Уязвимость хост-клеток р38 МАР-киназы и паразитарной PKG структурно связанных с ингибиторами, как представляется, в связи с наличием общего гидрофобного связывания кармана, который перекрывает сайт связывания АТФ. Предыдущие исследования Моделирование р38 МАР-киназы предложил избирательное взаимодействие между остатками в этом кармане и ингибитор лиганда (SB203580, рис 19.2), предсказание, которое впоследствии было подтверждено мутационного анализа (Gum и соавт., 1998;. Lisnock и соавт, 1998). В particu-LAR, когда р38 МАР-киназы остаток threonine106 замещена объемными остатков, таких как метионин или глутамина, связывание ингибитора предотвращается. Моделирование ферментов EtPKG или TgPKG в результате аналогичных предсказаний, идентифицированных связанное вмещающее взаимодействие между ферментом паразита и ингибитором лигандом. Apicomplexan PKG ферменты также имеет остаток треонина в этом положении ключа, в то время как позвоночная PKGs гавань метионина (CGK изоформ I) или лейцин остаток (CGK изоформы II), которые можно было бы предсказать интер-Феру с соединением связывания. В соответствии с моделью, этот остаток треонина делает тесный контакт с фторфенильной группой ингибитора. Как и в случае р38 МАР-киназы, замещение окончательного PKG каталитического остатка на сайте треонина метионина или глутамин (T770M / Q для EtPKG; T761M / Q для TgPKG) можно было бы ожидать, чтобы
518 Toxoplasma В качестве модельной системы ДЛЯ APICOMPLEXAN открытия новых лекарств
ХМПЗ 1
Ген Гидрофобного связывания кармана IC50 (НМ)
Bt-cGKI RTFKDSKYLYMLMEACLGGELWT(437) > 2000
Pf-PKG RTFKDSKYFYFLTELVTGGELYD(620) 3
Cp-PKG RTFKDSENIYLLTELIPGGELYD(699) й
Et-PKG RTFRDKEFLYFLTELVTGGELYD(770) 1
-T770M ------------ М ---------- >2000
-T770Q ------------ Вопрос ---------- > 2000
Тд-PKG RTFRDKEFLYFLTELVTGGELYD(761) 1
-T761M ------------ М ---------- > 2000
-T761Q ------------ Вопрос ---------- > 2000
-T761G ------------Г---------- 0,3
-T761A ------------ ---------- 0,4
Рисунок 19.3 Чувствительность apicomplexan паразита PKG к соединению 1 опосредуется каталитического остатка на сайте треонин. Метионин или глутамин замены делают фермент огнеупор к ингибитору. Глицин или аланин замена придает повышенную чувствительность. Et-PKG, Тд-PKG, Ср-PKG, Пф-PKG соответствуют PKG ферменты E. tenella, Т. гондий, parvum, C. и П. фальципарум, соответственно. Bt-cGKI является бычьей ортолог, цГМФ-зависимой протеинкиназы изоформы I. Идентичные и родственные аминокислоты заштрихованы свет и темно-серый соответственно. Цифры в скобках отражают положение по отношению к N-концу. ой, не сделано.
препятствовать связыванию ингибитора. Рисунок 19.3 сравнивает соединение 1 IC50значения, полученные рекомбинантной PKGs паразитов, различный мутантной DERIV-atives и контроль крупного рогатого скота cGKI. В то время как дикого типа паразита PKG ферменты обладают высокой чувствительностью к соединению 1 (ИС50 1-3 нМ), метионин или gluta-шахтные замены окончательного активного остатка на сайте треонина в tenella ферментов Т. гондий или E. являются огнеупором к ингибированию как бычий контроль cGK1 (ИСЫ50 > 2 μM) (см Donald и др., 2002). Замена TgPKG треонина 761 с помощью небольших остатков, таких как аланин или глицин фактически hypersensitizes фермента, чтобы соединение 1 (IC50 <1 нМ). Эти результаты свидетельствуют о том, что пространственные эффекты играют важную роль в разрешении доступа к этому гидрофобному связыванию карманы с помощью ингибитора лиганда. Эти данные также объясняют высокую степень селективности соединения 1 для целевого паразита PKG по сравнению с PKGs хозяина. Это важно, так как ингибирование ферментов ортологических хост-клеток можно было бы ожидать причиной токсичности в естественных условиях. Две изоформы человеческого PKG играют важную роль в желудочно-кишечном гладкой мышечной физиологии (cGKI) и гомеостаза жидкости (cGKII) и заглушек в
эти гены у мышей отобразить тяжелые фенотипы, включая нарушения желудочно-кишечного тракта и карликовости (Пфайфер и др., 1996, 1998).
Важно отметить, что, хотя ингибиторы р38 и ингибиторы PKG используют подобные уязвимости в каталитическом сайте связывания гидрофобного кармане, селективность по отношению к хост-клетки р38 МАР-киназа и паразитарной PKG четко включает в себя другие контактах каталитического сайта. Некоторые из наиболее высоко селективных ингибиторов р38 МАР-киназы используют дополни-тельные структурные особенности каталитического участка р38 МАР-киназы, которые не разделяют PKG (Fitzgerald и др, 2003;.. Натараян и др, 2003;. Стельмах и соавт, 2003). Обширные отношения структуры-активность (SAR) данные из ингибитора PKG программ медицинской химии р38 МАР-киназы, а также поддерживают концепцию, что потенции в стороне каждого фермента не обязательно связан между собой. Например, отношение ингибитора селективности р38 МАР-киназы по сравнению с паразитами PKG может варьироваться в зависимости от целых два порядка (100×) Для соединений класса 2,3-diarylpyrrole (например, соединение 1, рис 19.2). Для имидазопиридина соединений (например, соединение 2, рис 19.2), где свинец оптимизации
| ВАЛИДАЦИЯ цГМФа-зависимая протеинкиназа (PKG) - ПРИМЕР |
была сосредоточена отдельно на обоих PKG и на р38 МАР-киназы целей, это отношение может быть даже выше (> 1000×).
Использование токсоплазмов нокаутных штаммов экспресс-кий мутанты PKG, которые резистентны к соединению 1 ингибирования обеспечили недвусмысленный фармако-логической проверку на кокцидии PKG фермента в качестве терапевтической мишени. Паразиты, выражающие эти мутантные аллели PKG обладают высокой устойчивостью к соединению 1 в пробирке и в естественных условиях (Donald и др., 2002). Такие штаммы лекарственной устойчивости могут также служить в качестве инструментов, и соединения 1 в качестве реагента-компаньона, для исследования той роли, которую фермент PKG играет в биологии паразита. Согласно этой стратегии, участие PKG можно сделать вывод, где чувствительность процесса соединения 1 наблюдается у паразитов дикого типа, но не в сконструированном лекарственной устойчивости штамма. Таким образом, было показано, что PKG активность, и логического вывода цГМФ сигнализации, является Эссене-TiAl для моторики внеклеточного тахизоитами и их способности придают и вторгнуться клетки-хозяева (Wiersma и др., 2004). Может быть, удивительно, что внутриклеточный рост Eimeria tenella СПОРО-zoites и Toxoplasma тахизоитов является относительно устойчивым к воздействию суб-μУровни М соединения 1, которые блокируют инвазию паразита.
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что microneme секреции является неотъемлемой частью процессов, связанных с вторжением, таких как паразит подвижности и прикрепления хост-клеток (Kappe и соавт, 1999; Brossier. И др., 2003). Действительно, соединение 1 ингибирует секрецию micronemal адгезинов в Eimeria спорозоитов (EtMIC1 и EtMIC2) и в тахизоитах (TgMIC2). В противоположность этому, micronemal разряд, внеклеточная моторики, и инвазия хост-клетки остаются незатронутыми соединения 1 в трансгенных тахизоитов экспресс-ки соединения огнеупорный EtPKG или TgPKG мутантов, вовлекая PKG в этих процессах. Однако, PKG, конечно, не только протеинкиназа регулировать паразит моторику и инвазию. Кальций-отзывчивый кальмодулин-домен, как протеинкиназы (CDPK1) также участвует (Kieschnick и др., 2001).
и вторжение (Каррузерс и Сибли, 1999; Каррузерс и др, 1999a, 1999b;.. Ловетт и др, 2002; Ловетт и Сибли, 2003). Интересно, что ингибирование секреции TgMIC2 соединением 1 не зависит от таких модуляторов кальция, предполагая, что PKG действует ниже или, возможно, независимо от сигнальных путей кальция.
Открытие, что соединение 1 действует в первую очередь, чтобы блокировать вторжение хост-клеток согласуется с его цито-статическое воздействие на рост паразита наблюдается как в пробирке и в естественных условиях. Способность контролировать распространение паразитов, не устраняя их полностью объясняет также вклад иммунной системы хозяина к эффективности соединения 1, наблюдаемой в модели токсоплазмоза мышей (Нарэ и др., 2002). Соединение 1 может контролировать смертельную инфекцию RH штамма у мышей, присвоение долгосрочного выживания. В противоположность этому, соединение обрабатывают гамма-интерферон (ИФНγ) мышей с нокаутом поддаться быстро РЕЛА-тельно к инфекции. Дополнительный Протек-ние дает иммунной система может быть прослежено к кратковременному бессимптомному паразиту recrudes-ковому, что происходит после отмены медикаментозной терапии. В IFN-γнокаутный мышей, это recrudes-ценция не самоограничение и приводит к бесконтрольной пролиферации паразитов и смерти. Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что ингибиторы PKG также действуют цито-статический против Eimeria у цыплят и дополнительно подчеркнуть полезность токсоплазмы в качестве модельной системы для кокцидий паразитов.