Apicomplexan протеинкиназы в качестве терапевтических мишеней

На примере исследований мишени PKG, токсоплазмы оказались неоценимым генетическим

Таблица 19,1 Деятельность PKG и ингибиторов CDK и млекопитающих (purvalanols) против Т. гондий протеинкиназы цели. Противопаразитарная эффективность (поглощение урацила) и рекомбинантные действия протеинкиназы, анализировали, как описано (Donald и Освободитель, 2002; Дональд и др., 2005). Средняя IC ₅₀Значения (нМ) из нескольких экспериментов показаны, и были рассчитаны на основе кривых доза-ответ. Структуры соединений показаны на рисунке 19.2. Значения для других, чем соединение 2 соединений были взяты из Donald и другие. (2005).

и биохимическая система для исследования и Валите-знакомство целей потенциала протеинкиназы от кокцидий паразитов. Из добычи генома база данных клинический важных apicomplexans, то ясно, что эволюционная расстояние между основными протеинкиназами патогена и ортологами организма хозяина представляет дополнительную выжидательную-связь для селективного химиотерапевтического вмешательства (Kappes и соавт, 1999;. Doerig и др аль, 2002a;. Doerig, 2004). Данные из аффинной хроматографии экспериментов с иммобилизованным лигандом ингибитором предполагают, что паразит циклин-зависимых киназ (CDKS) и CK1 ферменты содержат каталитический сайт структурные особенности, которые отличают их от ортологических ферментов хозяина. Основываясь на знании CDK архитектуры каталитического сайта, CDK млекопитающего ингибитором purvalanol B (Рисунок 19. 2) был стратеги-ски соединены с хроматографической матрицей с помощью ее карбоксильной части и использовали для зондирования лизатов из источников, в то числе клеток млекопитающих, беспозвоночных и различные паразитов (протозойных Knockaert и др., 2000). Purvalanol В, и структурно родственных соединениях purvalanol А и aminopurvalanol А, хорошо охарактеризовано, высоко селективные ингибиторы млекопитающих CDK ферментов (серый и др., 1998;. Чанг и др, 1999). Аффинно очищенные ферменты были подвергнуты анализу микро-секвенирования, и спички были определены сравнения с базами данных генов. Хотя эта стратегия аффинности очистки удалась захватить CDK ферментов из большинства тканей животных, ортологичный паразит CD не удалась восстановить из L. Mexicana, Т. Тгурапозота, П. малярийных или Т. гондий. Вместо этого, одна полоса 2000). Purvalanol В, и структурно родственных соединениях purvalanol А и aminopurvalanol А, хорошо охарактеризовано, высоко селективные ингибиторы млекопитающих CDK ферментов (серый и др., 1998;. Чанг и др, 1999). Аффинно очищенные ферменты были подвергнуты анализу микро-секвенирования, и спички были определены сравнения с базами данных генов. Хотя эта стратегия аффинности очистки удалась захватить CDK ферментов из большинства тканей животных, ортологичный паразит CD не удалась восстановить из L. Mexicana, Т. Тгурапозота, П. малярийных или Т. гондий. Вместо этого, одна полоса 2000). Purvalanol В, и структурно родственных соединениях purvalanol А и aminopurvalanol А, хорошо охарактеризовано, высоко селективные ингибиторы млекопитающих CDK ферментов (серый и др., 1998;. Чанг и др, 1999). Аффинно очищенные ферменты были подвергнуты анализу микро-секвенирования, и спички были определены сравнения с базами данных генов. Хотя эта стратегия аффинности очистки удалась захватить CDK ферментов из большинства тканей животных, ортологичный паразит CD не удалась восстановить из L. Mexicana, Т. Тгурапозота, П. малярийных или Т. гондий. Вместо этого, одна полоса и спички были определены сравнения с базами данных генов. Хотя эта стратегия аффинности очистки удалась захватить CDK ферментов из большинства тканей животных, ортологичный паразит CD не удалась восстановить из L. Mexicana, Т. Тгурапозота, П. малярийных или Т. гондий. Вместо этого, одна полоса и спички были определены сравнения с базами данных генов. Хотя эта стратегия аффинности очистки удалась захватить CDK ферментов из большинства тканей животных, ортологичный паразит CD не удалась восстановить из L. Mexicana, Т. Тгурапозота, П. малярийных или Т. гондий. Вместо этого, одна полоса

что соответствует CK1 фермента был неожиданно очищен от всех этих паразитов вида. Чувствительность паразита CK1 для ингибиторов CDK purvalanol из млекопитающих была впоследствии подтверждена клонированию и характеристике изоформы Toxoplasma CK1 (Donald и др., 2005). Aminopurvalanol А (рис 19.2), наиболее мощное противопаразитарное соединение этого класса ингибиторов, показало, суб-μМ эффективность (IC₅₀ 350 нМ) и Selec-тивно ингибирует паразитом СК1 (ИС₅₀ 42 нМ), но не пройдет-клетки СК1 (ИС₅₀ 4 μМ). Взятые вместе, эти результаты дают импульс для дальнейшего изучения паразита CDK и CK1 ферментов в качестве chemothera-peutic мишеней. С клонированию и характеристике CK1 и CDK ферментов как Toxoplasma и Plasmodium (Barik и соавт, 1997;. Doerig и др, 2002b;. Khan и соавт., 2002;. Дональда и др, 2005), струк-ры на основе а также целевые подходы, основанные на скрининг теперь теоретически возможно.

Подобный аффинный лиганд подход был также использован для идентификации альтернативных целей р38 МАР-киназы ингибитор SB203580 (рис 19,2; Godl и др., 2003). Результаты этого исследования вызова ранних предположений о специфичности этого соединения для р38 МАР-киназы, и служить в качестве полезного урока о потенциальных ловушках, связанных с развитием ингибитора протеинкиназы в целом. Как и в случае purvalanol B аффинного лиганда, структурной информация, полученные от киназы / ингибитор сокристаллов были использован для разработки успешной стратегии р38 лиганда сцепления, основанной на определении доступных для растворителя участков для связывания ингибитора к линкерным молекулам на сефарозе

524 Toxoplasma В качестве модельной системы ДЛЯ APICOMPLEXAN открытия новых лекарств

шарик матрицы. Использование лизатов клеток HeLa, по крайней мере, восемь протеинкиназы, связанная с SB203580 производными матрицы, в том числе ожидаемого р38αцель. Специфичность предполагаемого белка киназы-лиганд взаимодействий было подтверждено в последующих анализах киназы в пробирке, и показали, что одна из киназ, РИК, было в два раза более чувствительны к SB203580, чем р38α предназначаться себя (IC₅₀ 16 нМ и 38 нМ для RICK и р38α, Соответственно). Два других киназ и ГАК СК1 (α, δ, а также ε изоформы) были в том же диапазоне чувствительности, как р38α, Эти результаты поднимают вопрос о селективности этого соединения и его широко описаны биологические эффекты, в том числе отказ в клинических испытаниях (Кумар и др., 2003).

Неожиданные дополнительные целевые протеинкиназы также были идентифицированы с purvalanol B ингибитором CDK лиганда в клетках млекопитающих (Knockaert и др., 2000). В скрининге различных типов клеток и ткани для purvalanol взаимодействующих белков, CDKs были идентифицированы в большинстве случаев, но несколько других киназ были также обнаружены в некоторых клеточных линиях, в том числе р42 / р44 МАРКА (ERK1 / 2). Хотя чувствительность p42 / p44 MAPK к aminopur-valanol А на пробирке составляет 10-100× ниже, чем у CDK1 / cyclinB, косвенные целевые специфические анализы целых клеток подтверждают, что в >5 μУровни м-antiprolif erative свойства aminopurvalanol А обусловлены ингибированием как P42 / P44 MAPK и CDKs (Knockaert и др., 2002). Очевидно, что высокая степень селективности трудно достичь с помощью ингибиторов протеинкиназы, даже для таких соединений, как в purvalanols, которые были уточнены обширной медицинской химии (серый и др., 1998). В результате, можно с уверенностью предположить, что большинство соединений будут иметь диапазон действия против нескольких целей протеинкиназы. Этот вывод имеет значение для ведущего процесса уточнения, где несколько мероприятий протеинкиназы, возможно, должны контролироваться с целью оптимизации efficay. Это может быть необходимо не только для протеинкиназ в целевом патогена, но и для тех, кто в клетке-хозяине, где офф-мишени действия могут внести свой вклад в клетке-хозяине токсичности.

Обычный промышленный подход к фармакологической проверке белковых мишеней киназ зависят от доступа к большим, струк-turally разнообразен, библиотекам малых молекул. элегантный

Альтернативный метод «химических Генетика», который обходит это требование и которые могут быть применены к apicomplexan паразитные киназ был разработан Kevan Shokat и его Labora-тории (Shokat и Velleca, 2002; Шпехт и Shokat, 2002; Shah и Shokat, 2003). Стратегия основана на построении киназы аллель, что делает целевой фермент однозначно отличить-способный от всех других киназ в геноме через его чувствительность к комплементарному ингибитору. Эта мутация является заменой универсально законсервированного громоздкима аминокислоты в АТФ-связывающий кармане, известной как «привратник» остаток. Когда этот остаток замещен на меньшие аминокислоты в различном целевых киназах, доступ к глубокой гидрофобной «специфичности» кармане создается, что имеет сильное сродство к модифицированному аналогу АТФ или ингибитору. В принципе, этот карман аналогично эксплуатировали естественным путем PKG соединений или структурно подобных ингибиторов р38 МАР-киназы (рис 19.2). Важно отметить, что разработан Мут-ции, как правило, молчит в терминах функции фермента (Witucki и др., 2002), что позволяет конкретную маркировку измененной киназы или белкового субстрату с помощью RADI-olabeled производного аналога соответствия АТФ. Небольшой собственный набор функциональных аналогов и АТФ мощных ингибиторов, которые соответствуют были синтезированы только сконструированные киназы и доступны по лицензии CGI Pharmaceuticals, Inc., Branford, CT (CGI). Некоторые из этих соединений являются сильнодействующими, клеточно-проницаемой, и имеют превосходную bioavail-способность в сочетании с низкой токсичностью у мышей. В результате, они могут быть использованы для оценки physiolog-ческого следствия ингибирования протеинкиназы как в пробирке и в естественных условиях. Естественно, что технология требует времени для построения питались-Ассигнования на штаммы замещения генов, в которых транс-генов, экспрессирующих модифицированную сенсибилизированные целевой киназы функционально замещает эндогенный ген копию дикого типа. Тем не менее, этот метод был использован с большим успехом для characteriza Тион ряда дрожжей и белка млекопитающих киназ и их клеточных субстратов (Holt и др., 2002; Shah и Shokat, 2002; Eblen и др, 2003;. Sekiya Kawasaki и др, 2003;. Sreenivasan и др, 2003;.. Ubersax и др, 2003;. Хиндли и др., 2004; Ван и др., 2004; Jones и др, 2005).