Эмпирического Скрининг для низкомолекулярных ИНГИБИТОРОВ

Несмотря на огромные инвестиции в высокопроизводительного скрининга (HTS) и комбинаторных технологии химии были сделаны в фармацевтической промышленности в течение 1990-х годов, развитие новых антибактериальных и противогрибковых препаратов упала далеко от ожиданий (Youngman, 2002; Projan, 2003; Маллин, 2004; Projan и Shlaes., 2004; Spellberg и др, 2004). В то время как на основе ферментов ВТСПЫсосредоточены на хорошо проверенные целях дали некоторые примеры селективных ингибиторов (Hackbarth и др., 2002;. Зеефельд и др, 2003), ни один новый препарату появился, несмотря на значительные усилия на свинцовом уточнении через медицинскую химию и структура на основе дизайна.

По существу, скрининг парадигма HTS применяется к микробным патогенам не удалась в результате ограниченного структурного разнообразия, присущем синтетических библиотеки соединений в сочетании с

514 Toxoplasma В качестве модельной системы ДЛЯ APICOMPLEXAN открытия новых лекарств

внутреннее отсутствие благоприятных свойств клеточной проницаемости. Построение требуемых фармакокинетические свойств в ВТСП ведут через медицинскую химию является достаточно сложным для любой программы развития, но превращение молекулы в наркотик, который также может свободно пересекать микробную клеточную стенку до сих пор оказалось чрезвычайно трудно. На арене натуральных продуктов, где часто выбранных для проницаемости по своей природе, проблема несколько отличается. Здесь задача состоит в том, чтобы иден-тифы новых антимикробных соединений из сырой бульонов ферментации, из которого широкий диапазон общих токсинов и антибиотиков уже добытых в течение нескольких десятилетий интенсивного био-разведки.

Как грибковых и бактериальных патогенов, APICOM-plexans создает дополнительные барьеры для проницаемости терапевтических соединений по сравнению с клетками млекопитающих. Для того, чтобы блокировать пролиферацию внутриклеточного паразита, соединение должно пройти через плазматическую мембрану клеток-хозяина, пару-sitophorous вакуоли мембрану, а также паразит плазматическую мембрану. Доступ к объектам в mitochon-drial или пластидах отсеков требует транспорта через дополнительные мембранные барьеры. Несмотря на то, вакуольная мембрана является проницаемой для небольших молекул, поверхность паразита не является (Schwab и др., 1994). В результате, эффективные противомалярийные и antitoxoplasmal препараты полагаются на сравнительно узком диапазоне физических свойств для расширения доступа к внутриклеточным мишеням. Например, эф-онно противопаразитарные антифолаты, такие как пириметамин, как правило, более липофильные, чем аналогичные препараты, ориентированных на клетки млекопитающих. В дополнении к липофильности, наркотики, таким как аминохинолины или артемизинин, которые предназначаются для малярийных пищи вакуоль имеют требуемое слабые базовое свойство, что способствует их улавливанию внутри этого отсека кислого (Egan и др., 2000;. Хиндли и др, 2002). В результате таких ограничений, на основе ферментов ВТСПОВ подходов для поиска новых потенциальных клиентов для борьбы с apicomplexan паразиты могут быть столь же бесплодными, как они были для антимикробных целей.

Оценку ограничений на основе целевых HTS в обнаружении антимикробного препарата привела к новому акценту на более эмпирическом

подход к скринингу библиотек соединений, в которых на основе клеток экраны используются в качестве первичного фильтра для идентификации новых антимикробных соединений. Используя эту стратегию, соединения, которые эффективно убивают возбудителя в пробирке быстро идентифицированы. Вторичные клеточные анализы на основе используется для устранения токсичных соединений и приоритезацию удары на основе спектра активности по отношению к связанным патогенам. то задача становится одним из идентификации механизма убийства, так что целевые анализы на основе может быть созданы для содействия свинцовых усилий уточнения. Примеры недавних успехов включают в себя открытие первой линии oxazolidi-линезолида ни один антибактериальный препарата (Ли и др., 1987), а также определение перспективного соединения для лечения туберкулеза (Andries и др., 2005). В обоих случаях,

Для apicomplexan паразитов, на основе клеток эмпирического скрининг уже давно парадигма для коммерческого анти-кокцидии усилия обнаружения наркотиков. Целевые организмы в данном случае являются различными видами птиц Eimeria, которые поражают заводскую выращиваемую птицу с крупными агрономическими воздействиями. Широкий спектр соединения coccidiostat должны использоваться профилактически в этих условиях, чтобы предотвратить пери-одическую вспышки. Трудность выращивания Егтепа в пробирке привела к использованию родственных, но более поддающихся кокцидиям как экспериментальные surro затворов. Токсоплазмы играют полезную роль в исследовании биохимического механизма коммерческих кокцидиостатов, а также при оценке их восприимчивости к лекарственной устойчивости (Пфефферкорн и соавт, 1988;. Хьюп и др, 1991;. Ricketts и Пфефферкорн, 1993). Для скрининга библиотек соединений, противопаразитарный анализ в пробирке с использованием мышиного apicomplexan Besnoitia jellisoni был обычно используется (Лунд и Jacobs, 1965; Ernst и др, 1968; Fayer. и др., 1969). Анализ представляет собой приспособление 96-луночный хост-клеточный монослой клирингового теста, который также был описан для токсоплазмов (Русо и др., 1994). Доступ в библиотек соединений, определенных таким образом, затем evalu-ованные на активность против Eimeria tenella в урацил-поглощения анализа вторичной радиометрической. В этом Доступ в библиотек соединений, определенных таким образом, затем evalu-ованные на активность против Eimeria tenella в урацил-поглощения анализа вторичной радиометрической. В этом Доступ в библиотек соединений, определенных таким образом, затем evalu-ованные на активность против Eimeria tenella в урацил-поглощения анализа вторичной радиометрической. В этом

случай спорозоиты, свежеприготовленные из спорулированного ооциста (Dulski и Turner, 1988), инокулирует на монослои клеток почек крупных рогатых скота Madin-Darby и паразитарной специфический урацил инкорпорацию Quan-titated (Шматц и др., 1986). Примеры свинец coccidiostat соединений, выявленные в эмпирическом скрининге включают в себя идентификацию натурального продукта ингибитор гистондеацетилазы апицидина (Дарькин Реттрей и др, 1996;. Мейнка и освободитель, 2001) и синтетического ингибитор протеинкиназы цГМФа-зависимые (Gurnett и др. 2002;. Biftu и др, 2005). Совсем недавно, Т. гондий стал организмом выбора для скрининга из-за его приспособляемость к более высоким пропускной способности форматов и легкости, с которой он может быть культивируемой в лабораторных условиях. Простые colorimeteric или флуорогенные анализы для токсоплазмы были разработаны на основе транс-геннаяβгалактозидазы и GFP репортер ферменты, которые облегчают быструю идентификацию активных соединений (Seeber и Бутройда, 1996; Макфэдден. и др, 1997;. Gubbels и др, 2003).

Пример 384-луночного Т. гондий βгалактозидазы скрининга пластина показана на рисунке 19.1. клетки HFF сначала высевали в 384-луночные планшеты для микротитрования. После того, как монослои конфлюэнтны, паразиты инокулировали в лунки и соединение, поставляемые с пин-инструментом (V и Р научного) до конечной концентрации 2-5μСоединения М. управления (C1, соединение 1; C2, соединение 2; Рисунок 19.2) включены для внутренней справки. После 4-5 дней роста, добавляются Colori-метрики CPRG субстрата и лунки, показывающие ингибирование роста паразита оценивали визуально. Скважины, где наблюдается торможение роста паразита появляются желтые, из-за отсутствия паразита-специфическогоβгалактозидазы деятельность. гистологическое исследование из «положительных» скважин используются для устранения соединений, в которых из-за неактивности для размещения-клеточной токсичности. Эффективность деятельности перспективных затем количественно в последующих разведениях доза-реакция. В этом примере пластины с экрана соединение библиотеки G-белком рецептор (GPCR), были идентифицированы один мощный и четыре слабо активные соединения. Для три других «хитов», отсутствие роста паразита приписывалось хозяйничать-клеточную токсичность. В этих случаях клетки HFF появились вакуолизированы, усохшие или лизису. Соединения, показывающие ПРОМ-изинговских уровни активности оценивают на активность

п

Токсичный активный

РИСУНОК 19,1 Противопаразитарный скрининг библиотек соединений с использованием трансгенных паразитов, экспрессирующихβгалактозидазу (Seeber и Boothroyd, 1996). Соединения поставляются из исходных пластин с помощью штифта инструмента до конечной концентрации 5 μМ. Пример 384-луночный скрининг пластины, показывая скважины с активным соединением (желтым). Пустые столбцы (1 и

24) не показаны. Эталонные соединения включены в качестве внутреннего контроля (C1 и C2). Скважины, показывающие признаки токсичности на хост-клеточный монослой HFF выделены красным цветом.

Эта цифра воспроизводится в цвете в разделе Цвет пластины.

против E. tenella спорозоитов. При антипаразитарной активность подтверждаются против Е. tenella в пробирке и где разрешениях доступности соединение испытывает на эффективность в естественных условиях в курином Eimeria модели.