Вторичные цели ингибиторов PKG в Toxoplasma

Соединение 1 и родственные 2,3-diarylpyrroles не являются достаточно мощным против паразитов Eimeria, которые будут разработаны в качестве экономически жизнеспособных кокцидиостатов, несмотря на их активность широкого спектра действия. Новый структурный класс ингибитора PKG впоследствии был найден за счет сочетания фермента-мишени на основе скрининга и антипаразитарной counterscreen-Ing. Перенаправленные лекарственные усилия химии, сосредоточен на имидазопиридин гетероциклического ядра, были в состоянии определить новый провод (соединение 2, Рисунок 19.2) (Biftu и др., 2006) с повышенной PKG потенцией и антипаразитарной активностью. Соединение 2 представляет собой двух- до пяти-5 раз более мощное, чем соединения 1 против кокцидий мишени PKG и пяти- до десяти раз более активны в отношении Eimeria и Toxoplasma паразитов в пробирке.₅₀ > 10 ìМ), подтверждают-ное общий механизм ингибирования (Donald, неопубликованные данные). Токсоплазмы PKG нокаута штамм, экспрессирующий такой PKG мутант может служить полезным инструментом для измерения степени, в которой соединение чувствительность зависит от цели PKG (Donald и др., 2002). Сравнение эффективности этих двух соединений против токсоплазмы культивируемых показана на рисунке 19.4. Для получения соединения 1 (панель А), огнеупорная штамм (PKG T761Q-KO, открытые треугольники) в 15 раз более устойчив, чем паразитов дикого типа (или против паразитов, экспрессирующих не-мутантный recombi-Nant PKG, не показан). В качестве уровней составного подхода 10ìМ, распространение лекарственной устойчивости штамма также становятся ингибируются, что предполагает титрование других внутриклеточных мишеней. В противоположность этому, refrac-тори штамм только пять раз более устойчив к соединению 2, чем паразитов дикого типа (панель В, сравните открыт с закрытыми кругами). Кроме того, штамм, устойчивый к более чувствителен к соединению 2, чем паразиты дикого типа к соединению 1 (панель A, закрытые треугольники), что свидетельствует о том, что в данном случае не-PKG мишень ингибируются при Thera-peutically значимого (суб-ìМ) уровней.

Привлечение потенциальных вторичных целей с более новым соединением является еще более

Соединение 2

РИСУНОК 19,4 Активность кокцидиоза ведет против токсоплазмы в пробирке. Доза ответ для ингибирования дикого типа (RH) и соединения огнеупора (TgPKG T761Q-КО) штаммов Т. гондий путем PKG соединений 1 и 2 (панели A, B, смотри рис 19.2). Метаболическая активность паразитов, растущих в монослоях HFF клеток определяли путем измерения³Н-урацил поглощение после 48 ч роста в Cytostar-T планшеты для культуры ткани сцинтилляционного (GE Biosciences). IC₅₀ Значения, генерируемые в этом репрезентативном эксперименте были вычислены с помощью подбора кривых программного обеспечения (GraphPad Prism v4).

pronouncedinanalogousexperimentsusing WhereasthePKGmutant Toxoplasma штамм

модель токсоплазмоз мыши (рис 19.5). (T761Q-КО) полностью невосприимчивыми к соединению 1

Около 90 процентов мышей зараженных с лечение (панель А, закрытые кружки), она остается

смертельная доза штамма дикого типа RH паразиты выживают частично чувствительны к соединению 2 (панель B, закрытый

долгосрочный при обработке соединения 1 или кружки). В этом случае зараженные мыши, получавшие

compound2atequivalentefficaciousdoses. с соединением 2 выживают 20 дней дольше, чем

Соединение 2

10 20 30 40

РИСУНОК 19.5 Активность кокцидиоза ведет против токсоплазмы в естественных условиях. Трансгенные Т. гондий экспрессировать соединение тугоплавкого PKG мутант (T761Q-KO) не чувствительны к соединению 1 (панель А), но частично Sensi-TIVE к соединению 2 (панель B) в модели токсоплазмоз мыши. Мышам вводили соединение по два раза в день IP инъекции (IP-ставка) в течение 10 дней на уровне (50 мг / кг дл соединени 1 и 25 мг / кг для соединения 2) следует, что выход ~ 90 процентов долгосрочного выживания паразитов дикого типа (RH).

522 Toxoplasma В качестве модельной системы ДЛЯ APICOMPLEXAN открытия новых лекарств

Аналогичное соединение 1 обрабатывает группа, которая поддается инфекции в то же время, как необработанный контроль. Взятые вместе, результаты в пробирке и в естественных условиях экспериментов свидетельствуют о том, что, хотя PKG, очевидно, является главной мишенью соединения 2, ингибирования других целей, также вносит свой вклад в его эффективность. Другими словами, соединение 2 является менее селективным ингибитором PKG, чем это соединение 1 - это свойство, которое имеет определенные преимущества при рассмотрении вопроса о возможности для лекарственной устойчивости. Способность соединение-ингибировать другие вторичные киназы, которые являются важными для пролиферации паразита имеет потенциал MITI-воротные проблемы лекарственной устойчивости. Конечно, способность генерировать устойчивость к соединению 1 в тахизоитах через одну мутации замещения - без видимой стоимости пригодности к ферменту - повышает Ques-ции о разработке ингибиторов структурны родственных как коммерческие кокцидиостаты. Возможно, на удивление, однако, предварительные результаты в tenella модели лекарственной устойчивости Eimeria у цыплят указывают на относительно благоприятный профиль лекарственной устойчивости для соединения 1. После нескольких циклов применения к Eimeria-инфицированных цыплят в суб-эффективной дозы, устойчивость к соединению 1 выходит со скоростью медленнее, чем для ампролиума, коммерческий coccidio-стат, которые выжили в течение более десяти лет использования до наступления резистентности (Тамаш Тамаша, Merck и Co, неопубликованные данные).

PKG нокаут штамм, выражающий Комплексы-ального ингибитор огнеупорного PKG мутант (T761Q-KO) был также использован в качестве инструмента для биохимического анализа для выявления вторичных целей, которые потенциально способствуют превосходной антипаразитарной эффективности соединения 2 (Donald и др., 2006), Отсутствие экспрессии нативного PKG в этом штамме обеспечивает идеальную основу для обнаружения присутствия других ферментов с сильным сродством к соединению 2. С помощью меченного трития соединения 2 в качестве лиганда, фильтр Анализ связывания был использован для отслеживания активности во фракции-ованной сырых лизатах тахизоиты, таким же образом, используется для идентификации первоначально PKG в качестве основного внутриклеточного целевого соединения 1 в Eimeria и в Toxoplasma (Donald и др., 2002;

Gurnett и др., 2002). Одиночный пик соединения 2 связывающей активности был определен следующей fractiona-ние на ионообменном и гидрофобных колонках хроматографии. Биохимический характер-зации из частично очищенного соединения 2 связывающей активности показало, что она соответствует нуклеотидной-независимой протеинкиназы с предпочтением для молочного казеина в качестве субстрата и свойств, имеющих внешнее сходство с казеин-киназы 1 (CK1). Этот результат послужил стимулом для клонирования и характеристики двух изоформ (альфа и бета) из Toxoplasma казеин-киназы I, один из которых показал некоторую чувствительность к ингибиторам PKG (Donald и др., 2005). Однако последующие пептиды антисыворотка серология показала, что соединение 2 активности связывания с последующей в фракционированных экстрактах тахизоят не была классический казеин-киназой (тип 1 или 2), фермент, а скорее ранее характеризуются кальций-зависимого кальмодулиным-домен, как протеинкиназы (1) (CDPK1 Kieschnick и др., 2001). Зависимость кальция его активность стала очевидной, когда пептидные субстраты были оценены в пробирке в анализах вместо казеина молока, сам по себе является источником кальция. Примечательно, что частично очищенный или recombi-Nant CDPK1 был по крайней мере столь чувствительны к соединению 2 как PKG (суб-нМ). Чувствительность Toxoplasma PKG, CDPK1, и CK1 ферментов в соединение 1 и соединение 2 приведены в таблице 19.1. Соединение 2 является значительно более сильным ингибитором CDPK1 и CK1 сам по себе является источником кальция. Примечательно, что частично очищенный или recombi-Nant CDPK1 был по крайней мере столь чувствительны к соединению 2 как PKG (суб-нМ). Чувствительность Toxoplasma PKG, CDPK1, и CK1 ферментов в соединение 1 и соединение 2 приведены в таблице 19.1. Соединение 2 является значительно более сильным ингибитором CDPK1 и CK1 сам по себе является источником кальция. Примечательно, что частично очищенный или recombi-Nant CDPK1 был по крайней мере столь чувствительны к соединению 2 как PKG (суб-нМ). Чувствительность Toxoplasma PKG, CDPK1, и CK1 ферментов в соединение 1 и соединение 2 приведены в таблице 19.1. Соединение 2 является значительно более сильным ингибитором CDPK1 и CK1α ферменты, чем соединения 1, обладающие значительно меньше селективности по отношению к мишени, чем соединения PKG 2. вероятно, значение вторичной мишени CK1 были освещены открытием, что ближайший ортолог кокцидий CK1αв Leishmania основных promastigotes (LmCK1-2) несет ответственность за их восприимчивость к соединению 2 и другие ингибиторы имидазопиридина (Allocco и др., 2006). Дальнейшие исследования направлены на изучение степени, в которой кокцидии CDPK и CK1 ферменты способствуют антипаразитарной эффективности этих соединений, а также понять структурную основу для ингибитора активности.